[发明专利]一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法

说明书

本申请是2012年2月10日、申请号为201210030197.4的发明专利《一种简单高效制备人γδT细胞的方法》的分案申请。

技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法。

背景技术

T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)的不同分为两类：TCRαβT细胞和TCRγδT细胞，分别简称为αβT细胞和γδT细胞。其中γδT细胞是介于特异性免疫与非特异性免疫之间的一种特殊类型的细胞，大多数为CD4和CD8分子双阴性，少数可表达CD8分子。γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织，一般不超过T细胞总数的5%。γδT细胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体免疫监视的第一道防线。但由于γδT细胞在外周血和肿瘤组织中含量不高，要获得大量高细胞毒活性的γδT细胞是十分困难的。虽然已有技术通过抗TCRγδ抗体或非肽磷酸类抗原获得大量γδT细胞，这无疑会增加其制备的成本。经广泛查阅国内外专利文献和各种出版物，迄今为止，均未见有实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的发明或报道。因此发明一种实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的方法，对于γδT细胞免疫功能的研究，并用其提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能力是非常重要的，对于攻克人类渴望解决的恶性肿瘤性疾病这一难题也是十分有价值的。在人外周血γδT细胞制备后需要对其进行形态学、纯度及免疫表型检测，确保成品符合要求。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法。用于检测人γδT细胞。

本发明所采用的技术方案是：一种制备人γδT细胞的方法，包括如下步骤：培养结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）并制备结核杆菌耐热性抗原（Mycobacterium tuberculosis heated antigen，Mtb-HAg），采集并分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），用Mtb-HAg激活，同时加入细胞因子rhIL-2和rhIL-21，置于37℃，5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2～3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2.0）×10⁶/ml。10～15天即可以获得大量、高细胞毒活性的γδT细胞。所述的Mtb培养基为苏通式液体培养基或者Middlebrook7H9，Mtb经过高压蒸汽处理，并经离心超滤制备成Mtb-HAg。所述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得。所述Mtb-HAg的终浓度为5～10μg/ml，rhIL-2的终浓度为50～500IU/ml，rhIL-21的终浓度为5～20ng/ml。根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10～15天。

本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

细胞培养24小时即可见γδT细胞沉于培养器皿的底部，并趋于集落化，48小时集落开始变大，培养6～10天即可以看到大的集落和不规则的单个核细胞。对培养10天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见1个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。取培养10天的细胞100μl，加入100μl0.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。

分别取第0、7、14、21和28天的细胞，用含5%新生牛血清和0.1%叠氮纳的PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×10⁶/ml，每个检测管内加入50μl细胞悬液，加入荧光标记抗体（抗CD3-FITC、抗TCRγδ-PE）染色，4℃避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用WinMDI软件分析。