[发明专利]一种人第VIII凝血因子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种人第VIII凝血因子的制备方法。

背景技术

凝血因子VIII制剂与白蛋白制剂、免疫球蛋白制剂在国外同为血浆蛋白制剂的三大支柱产品，在血友病中，80%的病人属于甲型血友病，该类病人主要缺少正常人所拥有的人凝血因子VIII，因此，人凝血因子VIII是治疗血友病的救命药。目前国内仅有少数几家具有人凝血因子VIII的生产批文，主要是工艺操作繁琐，质量不易控制。现有生产工艺生产人凝血因子VIII产品得率低，面对国内人凝血因子VIII的短缺，现阶段研发生产安全性高、比活性高的人凝血因子VIII具有积极意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单，产品质量可控的制备人凝血因子VIII的方法。

一种人第VIII凝血因子的制备方法，包括如下步骤：

（1）从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，用3倍的0.01-0.05mol/L的Tris-HCl溶解液溶解；反应液温度控制在24～26℃，加入肝素钠作为保护剂，终浓度为0.005-0.065%；

（2）一次PEG沉淀：向溶解液中加入30%浓PEG1溶液，溶液中最终PEG浓度为2%-6%，调节溶液pH值至6.5～7.5，搅拌静置后离心；

（3）收集离心后的上清液，经澄清过滤后，根据过滤后的体积加入S/D病毒灭活液，使溶液中Tween-80含量为11.0％、TNBP含量为3.3％，反应液温度控制在24-26℃，保温6小时；

（4）二次PEG沉淀：将灭活后的所述反应液澄清过滤，滤液转至低温反应罐，准确计量过滤液体积，在搅拌条件下加入40%PEG2溶液，溶液中PEG浓度为10%-16%，调节溶液pH值至5.4～6.0，搅拌静置后离心；

（5）沉淀洗涤：收集沉淀，用10%的甘氨酸溶液洗涤3次，洗涤完全后离心，收集沉淀；

（6）用1%的甘氨酸溶液溶解，溶解液调pH至7.1～7.3，过滤，配制、除菌分装，冻干、轧盖，干热灭活得到人凝血因子VIII成品。

本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（1）冷沉淀的制备方法为：

生产用血浆符合《中华人民共和国药典》2010版三部“血液制品生产用原料血浆”规定，血浆应无凝块，无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。采集后应在4小时以内冻结，-30℃保存不超过1年；

冰冻血浆在0-4℃融化，经低温高速离心，离心过程中血浆温度控制2-8℃，收集沉淀；即为冷沉淀。

本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（2）PEG1溶液的配方为：PEG为30%、Na₃Cit·2H₂O为1%，用1.0mol/LHCl溶液调PH为6.2～6.4。

本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（4）PEG2溶液的配方为：PEG为40%、Na₃Cit·2H₂O为1%，用1.0mol/LHCl溶液调PH为6.2～6.4。。

本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（5）具体包括如下步骤：

配制甘氨酸洗涤液：取甘氨酸0.232kg、柠檬酸三钠0.133kg、肝素钠0.142kg、加注射用水1.4kg，用1.0mol/L HCl溶液调pH为6.65～6.75，配制好后降温至-1.0～1.0℃备用；

沉淀洗涤：收集沉淀，第一次加9-12倍沉淀量的甘氨酸洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀；第二次加13-15倍沉淀量的洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀；第三次加18-20倍沉淀量的洗涤液，充分粉碎洗涤沉淀，离心收集沉淀。

本发明所述的人第VIII凝血因子的制备方法，其中步骤（6）具体包括如下步骤：

配制溶解液，取甘氨酸90g，含2个结晶水放入柠檬酸三钠23.5g，加25～35℃注射用水溶解成10L，用1.0mol/L HCL溶液调pH至7.1～7.3；温度控制在25～35℃之间；

用13～15倍溶解液溶解沉淀，缓缓搅拌至完全溶解；溶解后澄清过滤，收集上清，除菌分装，冻干、轧盖，干热灭活得到人凝血因子VIII成品。

本发明所述方法制备得到的产品，制备得到的所述人凝血因子VIII效价为不低于35IU/ml，比活不低于10IU/g蛋白质。

本发明人第VIII凝血因子的制备方法优点在于：