[发明专利]一种用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及SPR传感检测领域，特别涉及一种用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法。

背景技术

肿瘤治疗是目前的研究热点，化疗是时下治疗恶性肿瘤的主要方法，然而肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药是实现治疗的主要障碍之一，也是多数肿瘤患者治疗后效果不佳的重要因素。多药耐药蛋白(MDR1)属于ATP能量依赖型跨膜转运蛋白，对于外源药物具有选择性与特异性外排的功能。目前的大量研究均表明，MDR1的过表达是多药耐药的重要原因之一。因此，抗肿瘤药物筛选中均将MDR1对药物的识别能力作为重要依据，同时，多药耐药现象的研究中也将MDR1作为主要内容之一。

表面等离子共振传感技术(SPR)发源于上世纪80年代，因其免标记、快速灵敏以及实时监测特性，被广泛应用于生物大分子相互作用、大分子与小分子相互作用、药物筛选以及肿瘤研究中。基于该技术开发的芯片与仪器已经高度商业化，目前国外主要有Biacore、IBIS等系列，国内也有中科院电子所研制的各型号仪器与芯片出售，然而这些芯片中还未有研究多药耐药现象及机理的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，以填补国内市场上研究抗肿瘤药物及多药耐药机理所用SPR传感芯片的空白。

本发明提供一种用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，以市售的传感片L1为基板，在所述基板表面偶联含MDR1的微囊泡。

优选地，所述的用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，以市售的传感片L1为基板，将所述基板放入BIAcore3000仪器中，注入磷酸缓冲液使其以15～25微升／分钟的流速持续流经基板表面，随后又向该仪器中以15～25微升／分钟的流速注入15～25mM的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸水溶液，注入持续时间为2～4min；用磷酸缓冲液冲洗所述基板，最后向该仪器中注入含MDR1的微囊泡悬浮液，当所述BIAcore3000仪器中折射率的信号变化参数RU值达到5500时，停止注入含MDR1的微囊泡悬浮液，待磷酸缓冲液冲洗掉未结合的微囊泡后，得到表面偶联有MDR1的微囊泡的L1-MDR1芯片。

优选地，所述的用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，所述的含MDR1的微囊泡悬浮液采用如下方法制得：将市售的MDCK-MDR1细胞进行平板培养，待MDCK-MDR1细胞生长至90％融合后，对其进行胰酶-EDTA消化，离心，并重新悬浮于磷酸缓冲液中；将含MDCK-MDR1细胞的磷酸缓冲液放入超声仪中，经超声破碎与蔗糖密度梯度离心后，取离心液的中间层，将所述中间层悬浮于含250mM蔗糖的50mM Tris缓冲液中，从而获得含MDR1的微囊泡悬浮液。

优选地，所述的用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，在超声破碎时，超声频率为250Hz，超声时间为3min。

优选地，所述的用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，在蔗糖密度梯度离心时，蔗糖浓度为38wt％，离心速度为10000g，离心时间为100min，温度控制在4±0.1℃。

优选地，所述的用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，在获得所述的含MDR1的微囊泡悬浮液后，将其注入BIAcore3000仪器前，还包括对所获含MDR1的微囊泡悬浮液进行鉴定：采用磷酸苯二钠比色法检测微囊泡中碱性磷酸酶的活性；采用荧光底物或同位素底物转运法测定MDR1的蛋白活性；采用BCA法检测含MDR1的微囊泡悬浮液中的蛋白总量；将以上测定参数进行比对，得出所获含MDR1的微囊泡悬浮液中微囊泡的纯度及活度；采用动态光散射仪测定微囊泡的直径分布，直径在150～300nm之间的才能注入BIAcore3000仪器中。

优选地，所述的用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，在制得L1-MDR1芯片之后，还包括对其进行表面覆盖率检测：将所述L1-MDR1芯片置于BIAcore3000仪器中，注入含有0.1mg／ml牛血清白蛋白的磷酸缓冲液，当RU值的改变量小于50时，表明芯片表面已完全被微囊泡覆盖，最后取出并用氮气吹干即可用于后续的检测试验。

优选地，所述的用于筛选抗肿瘤药物的SPR传感芯片的制备方法，动态光散射仪的光源系统为氦离子激光系统，光源波长为633nm，动态光散射仪工作温度为25±0.1℃。