[发明专利]用于生产聚-4-羟基丁酸酯的遗传工程微生物

权利要求书

1.一种增加自可再生原料产生4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产量的方法，包括：

a)提供具有修饰的C4代谢途径的遗传修饰生物体，以及

b)提供一种或多种稳定表达的基因，所述基因编码具有以下活性的一种或多种酶：i)催化α-酮戊二酸脱羧成为琥珀半醛；ii)催化丙二酰辅酶A转化成丙二酸半醛；iii)催化L-乳醛转化成L-1，2-丙二醇并具有增加的氧化应激抗性；iv)催化延胡索酸为琥珀酸；v)催化丙酮酸的羧化；或vi)催化NADH成为NADPH；其中，与野生型或步骤a)的遗传修饰生物体相比，所述产物或聚合物的产量提高，和/或来自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的碳流量得以增加。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述4-碳产物选自：γ-丁内酯、1,4-丁二醇、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、琥珀酸、1,4-丁二酰胺、琥珀腈、琥珀酰胺和2-吡咯烷酮(2-Py)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述具有修饰的C4代谢途径的生物体具有修饰的聚-4-羟基丁酸酯途径且聚-4-羟基丁酸酯的产量增加。

4.根据前述权利要求任何一项所述的方法，其中，所述稳定表达的一种或多种基因编码一种或多种酶，所述一种或多种酶选自：α-酮戊二酸脱羧酶、2-酮戊二酸脱羧酶、丙二酰辅酶A还原酶、NADH-依赖性延胡索酸还原酶、氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、丙酮酸羧化酶和NADH激酶。

5.一种增加4-羟基丁酸或聚-4-羟基丁酸酯的产量的方法，包括：

a)提供具有修饰的4-羟基丁酸代谢途径的遗传修饰生物体，以及

b)提供稳定表达的一种或多种基因，所述一种或多种基因编码选自以下的一种或多种酶：α-酮戊二酸脱羧酶或2-酮戊二酸脱羧酶、具有将琥珀酰辅酶A转化成琥珀半醛的活性的丙二酰辅酶A还原酶、具有将SSA转化成4-羟基丁酸的活性的氧化应激抗性1,2-丙二醇氧化还原酶、具有将延胡索酸转化成琥珀酸的活性的NADH-依赖性延胡索酸还原酶、具有转化丙酮酸以形成草酰乙酸的活性的丙酮酸羧化酶以及其中增加细胞内NADPH浓度的NADH激酶，其中所述表达增加了4-羟基丁酸或聚4-羟基丁酸酯的产量。

6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述一种或多种酶选自：来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物、来自聚球藻sp.PCC 7002的2-酮戊二酸脱羧酶或其突变体和同源物、来自勤奋金属球菌的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物、来自Sulfolous tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶或其突变体和同源物、来自大肠杆菌的氧化应激抗性-1,2-丙二醇氧化还原酶、其突变体和同源物、来自布氏锥虫的NADH-依赖性延胡索酸还原酶、其突变体和同源物、来自乳酸乳球菌的丙酮酸羧化酶、其突变体和同源物以及来自构巢曲霉的NADH激酶、其突变体和同源物。

7.一种增加自可再生原料产生4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的产量的方法，包括：

提供具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的遗传修饰生物体，使得与没有该降低活性的野生型生物体相比，所述遗传修饰生物的生长受损；以及

提供一种或多种稳定表达的基因，所述基因编码具有催化α-酮戊二酸脱羧成琥珀半醛的活性的一种或多种酶；其中生长被改善，且来自可再生原料的4-碳(C4)产物或4-碳单体的聚合物的碳流量增加。

8.一种在具有聚-4-羟基丁酸酯途径的遗传修饰生物体(重组宿主)中产生更多的聚-4-羟基丁酸酯的方法，包括由所述宿主生物体稳定表达编码α-酮戊二酸脱羧酶或2-酮戊二酸脱羧酶的基因，其中，所述α-酮戊二酸脱羧酶或2-酮戊二酸脱羧酶催化α-酮戊二酸至琥珀半醛的脱羧反应，并增加所述生物体中聚4-羟基丁酸酯的量。

9.根据前述权利要求任意一项所述的方法，其中，所述酶是来自Pseudonocardia dioxanivorans的α-酮戊二酸脱羧酶或其突变体或同源物，或者所述2-酮戊二酸脱羧酶来自聚球藻sp.PCC 7002或其突变体和同源物。