[发明专利]罗丹明化合物及其作为荧光标记物的用途

说明书

本发明涉及新的罗丹明化合物及其作为荧光标记物的用途。该化合物可以在核酸测序应用中用作用于核苷酸的荧光标记物。

本发明涉及新的罗丹明化合物及其作为荧光标记物的用途。该化合物可以在核酸测序应用中用作特别地用于核苷酸标记的荧光标记物。

背景

在本申请中参考若干出版物和专利文献以便更充分地描述本发明所属的领域的现状。这些出版物和文献中的每个的公开内容通过引用并入本文。

利用荧光标记物的核酸的非放射性检测是分子生物学中的重要的技术。在重组DNA技术中采用的许多程序之前严重依赖于用例如32P放射性地标记的核苷酸或多核苷酸的使用。放射性化合物允许核酸和其他感兴趣的分子的灵敏的检测。然而，在放射性同位素的使用中有严重的限制，诸如它们的费用、有限的储存期以及更重要的安全考虑。排除对放射性标记物的需求提高了安全性，同时降低了与例如试剂处置相关的环境影响和成本。经得起非放射性荧光检测的方法通过非限制性实例的方式包括自动DNA测序、杂交法、聚合酶链反应产物的实时检测和免疫测定。

对于许多应用，期望采用多重光谱可区别的荧光标记物以便实现多个空间上重叠的分析物的独立检测。在此类多重方法中，反应容器的数目可以减少，这简化了实验方案并且有助于生产特定应用的试剂盒。在多色自动DNA测序中，例如，多重荧光检测允许在单个电泳泳道中分析多种核苷酸碱基，从而使总处理能力(throughput)增加超过单色方法并且降低与泳道之间的电泳迁移率变化相关的不确定性。

然而，多重荧光检测可能是有问题的并且存在限制荧光标记物的选择的许多重要因素。首先，难以发现发射光谱被适当地光谱分辨的染料化合物。此外，当若干荧光染料一起使用时，同时激发可能是困难的，因为染料的吸收带通常被宽泛地分开。许多激发方法采用高功率激光并且因此染料必须具有足够的光稳定性以经受这样的激光激发。分子生物学方法中的特别重要的最终考虑是荧光染料必须与使用的试剂化学物质诸如例如DNA合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶相容。

随着测序技术发展，需要开发另外的荧光染料化合物、其核酸缀合物和满足所有以上限制并且特别经得起高通量分子方法例如固相测序及类似方法的染料组。

申请WO2007135368描述一类适合于用作荧光标记物的罗丹明化合物。其中描述的化合物适合用于固相核酸测序方案中。固相核酸测序的技术和通量的发展特别地在荧光试剂和特定的核酸序列之间的相互作用的情况下已经导致对荧光标记物的分子设计的进一步发展和改进。

具有改进的荧光性质(诸如，荧光强度、荧光最大值的位置以及荧光带的形状)的荧光染料分子可以改进核酸测序的速度和准确性。当在基于水的生物缓冲液中和/或在较高温度下进行测量时，荧光信号强度尤其重要，因为大部分染料的荧光在这样的条件下显著较低。此外，染料被附接至的碱基的性质也影响荧光最大值、荧光强度和其他光谱染料性质。荧光染料和核碱基(nucleobase)之间的序列特异性相互作用可以通过荧光染料的特定设计来调整。荧光染料的结构的优化可以改进它们的荧光性质并且还改进核苷酸并入的效率、降低测序误差的水平并且减少核酸测序中试剂的使用，并且因此降低核酸测序的成本。

本文描述改进的罗丹明构建体和其作为生物分子标记物、特别地作为用于核酸测序中使用的核苷酸的标记物的用途。可以看到在此类染料(当制备为生物分子缀合物时)的较高荧光强度上以及在使用新的荧光构建体可获得的测序读数的长度和质量上的改进。

概述

根据第一方面，本发明提供式(I)的罗丹明染料化合物及其内消旋体：

本发明的内消旋体可以包括由1a、1b或环形式1c代表的式：