[发明专利]一种改变植物花型的双35S过表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种改变植物花型的双35S过表达载体及其应用。 

背景技术

花型是花卉作物重要的观赏性状, 通过分子生物学手段鉴定出控制花发育的基因并通过改变其表达方式, 可有目的地改变花型, 将对花卉业产生重大影响。对模式植物拟南芥和金鱼草突变体的遗传分析和同源异形化现象的研究表明, 编码转录因子的一组同源异形基因控制着花的发育。这些基因被相应地分为A，B和C类，并随之提出花器官发育的ABC基因模型。在经典的ABC模型中，认为花器官是由A，B和C三类基因共同作用的结果，以拟南芥为例，A类基因 (APETALA1, AP1；APETALA2, AP2)单独决定萼片，A类基因和B类基因 (APETALA3, AP3; PISTILLATA, PI) 共同决定花瓣，B类基因和C类基因 (AGAMOUS, AG) 共同决定雄蕊，C类基因单独决定心皮，同时，C基因还参与分生组织决定性的调控。这三类基因利用单独或重叠的基因表达区域对花发育过程进行调控，形成相应的花器官。随着研究的进展，ABC模型逐渐发展为ABCDE模型，D类基因SEEDSTICK（STK）的功能与C基因部分重叠，影响胚珠的发育。E基因SEPALLATA1-SEPALLATA4（SEP1-SEP4）在全局上对花瓣、雄蕊和雌蕊进行调控。通过改变同源异形基因的表达方式，按人们需要设计新的花型已成为可能。如利用转基因技术抑制AG基因的表达，其雄蕊被花瓣取代，心皮被新的花替代，形成重瓣花，为创造观赏价值较高的重瓣花展示了美好的前景。将矮牵牛同源异型基因FBP2与35S启动子相连，构建表达载体PBP2导入烟草，导致烟草雄蕊上产生花瓣。将英国梧桐的花器官决定基因PaAG(C类基因)转化烟草后, 花瓣的形态发生了很大变化。OsMADS58属于水稻C功能基因，通过分析OsMADS58的RNAi植株发现其雄蕊会部分转化成浆片，产生包含浆片、雄蕊和类似心皮在内的一系列花器官反复发生。鉴于OsMADS58在花发育中的重要作用，推测通过提高该基因的表达水平可改变植物的花型。启动子在决定基因表达方面起关键作用，选择合适的启动子是增强外源基因表达首先要考虑的问题。35S启动子是目前植物基因工程中使用最多的组成型启动子, 相关研究表明2×35S启动子的强度要远远高于单35S。为更大限度地提高OsMADS58的表达水平来改变花型，利用2×35S启动子来调控OsMADS58的超量表达具有一定的实践意义。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种改变植物花型的双35S过表达载体及其应用，该载体含有来自水稻C功能基因OsMADS58基因的上游连有2×35S组成型启动子。所述OsMADS58的cDNA来源于水稻（Oryza sativa），GenBank登录号为AB232157。 

本发明的另一目的是将该载体应用在植物特别是花卉中改变花型。 

 上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为含双35S的pHB。 

 本发明的上述植物表达载体为pHB-2×35S-OsMADS58，由下述方法构建而成： 

  (1) 根据NCBI上水稻OsMADS58的公布的序列（登录号为AB232157），设计引物为：

上游引物：5′-GGATCCATGCACATATACAAAGAGCAGGA-3′

下游引物：5′-TCTAGATTATCTTTCATCTGACATAAAGG-3′

上游引物添加BamH I位点，下游引物添加XbaI位点，以水稻第一链cDNA为模板扩增，获得OsMADS58基因的全长cDNA；

(2)  回收并纯化OsMADS58全长cDNA片段，并将其连接到pMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-OsMADS58