[发明专利]质谱法鉴别肉制品中动物源性成份

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴定肉制品中动物源性成分的检测方法及产品，具体而言是利用PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对猪、牛、羊、鸡、鸭、兔源性成分进行检测的方法及相应的试剂盒。

背景技术

肉制品是人类饮食中的重要食品，其含有优质蛋白和多种必须氨基酸，具有很高的营养价值。随着人们饮食结构的不断改变，增加了对肉类食品的需求，市场上出现了很多以次充好、假冒牛肉和羊肉的现象，例如，常见的使用鸡鸭猪肉充当羊肉，选用猪兔肉冒充牛肉，这严重损害了消费者的财务和健康状况。

另外，由于疯牛病、猪牛口蹄疫、禽流感等疾病的发病与流行，导致在特定时期内猪牛羊肉以及鸡鸭肉滞销。在该特定时期内，如果食品监管不力，容易发生不法商贩将滞销肉充当其它肉制品的事件。因此，需要严格限制食品中的动物源性成分。

此外，我国是一个多民族组成的国家，宗教习惯使人们的饮食有一定差异，对肉制品的选择具有一定的倾向性。例如：回族不吃猪肉。如果清真食品中掺有猪肉，会影响回族消费者的宗教信仰。同时，一些患病人群如高血压、脂肪肝等患者对肉类的选择具有一定特殊性。因此，食品中动物源性成分的鉴别已成为人们特别关注的问题。对肉制品中生物种属的鉴定在打击食品掺假伪造、审核食品标签、保障消费者知情权等方面有重要作用。

为了保护消费者的利益和进出口贸易的公平，对肉制品进行检测也具有一定的社会和经济意义。传统的肉制品检测采用形态学、免疫学方法，仅对生鲜肉具有一定的鉴别作用。但对经过加工处理的熟肉制品，由于其感官性状、蛋白质成分和其它免疫源性物质被破坏，使得传统的方法很难进行准确的肉类品种鉴定，给肉制品的交易和进口带来了极大的不便。

中国专利申请200710175520.6、“鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重PCR快速检测试剂盒及其应用”，该方法能够快速鉴别动物源性成分，但难以对肉制品中微量成分进行准确鉴定，且需要进行电泳凝胶判断结果，导致不够经济实用。

中国专利申请2012101870313、“特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法”公开了一种特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，其包括五组相互独立的A1-A5型反应液，该五组反应液可分别检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉和羊肉。然而，该方法需要对每组反应液设置2个梯度的扩增引物体系，同时每组涉及一组外引物和内引物以及一组环引物对，共计6种引物，且没有各组体系之间没有通用引物，因此导致整个过程设计繁琐、且引物之间相互干扰，从而从一定程度上影响了检测准确性。另外，该申请的实施例中只能同时检测两种肉制品，并不能同时检测两种以上的肉源。

中国专利申请200810243974.7、“一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中源性成分的方法”，涉及PCR法，通过设计特异性引物，进行PCR，根据扩增产物的大小及有无鉴定肉制品中动物源性成分。该方法过程需要进行大量的凝胶电泳，分析其凝胶图谱，整个过程较为繁琐，仍然停留在传统PCR检测技术。

发明内容

本发明原理在于：提供了一种联合PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，鉴定肉制品中动物源性成分的检测方案。其中：使用一对通用引物进行PCR扩增；在单碱基延伸过程中，对PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物延伸一个核苷酸；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质。

因此，本发明第一个目的是提供一种鉴定肉制品中动物源性成分的引物系统或引物组，其序列如表1所示。

其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表2所示。

在一个实施方案中，上述PCR扩增引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag（ACGTTGGATG），例如，PCR引物SEQ ID NO:1在5'段加入10bp的tag（ACGTTGGATG）后即为SEQ ID NO:9：5'-ACGTTGGATGCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

CAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT

本发明第二个目的是提供了由上述引物系统所制备的用于鉴定肉制品中动物源性成分的产品。