[发明专利]一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及应用。

背景技术

维生素B2，又称核黄素，是一种黄色的天然水溶性B族维生素。维生素B2作为人体必需的13种维生素之一，微溶于水。核黄素是机体内许多酶系统的重要辅基－黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)与黄素单核甘酸(FMN)的组成成分。作为黄素蛋白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸作用和生物氧化的代谢过程中起着重要的作用，是生命活动必需的维生素，是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的营养物质。此外核黄素已作为饲料添加剂、食品添加剂及色素广泛应用于饲料、食品、医药等领域。

核黄素的生产工艺主要有4种：植物体提取法、化学合成法、半微生物发酵合成法和微生物发酵法。在工业上应用的核黄素生产方法主要为微生物发酵法和半微生物发酵合成法两种。半微生物发酵合成法工艺简化、成本较低，长期以来是核黄素工业生产的主要方法之一，半微生物发酵合成法生产核黄素的过程中原料浪费较大，耗能比发酵法高；其次是生产中需要大量的有机溶剂甲酸具有强烈的刺激性和腐蚀性，环境污染严重。相较于化学合成法和半微生物发酵合成法，微生物发酵法具有微生物发酵法是后来发展起来的一种十分经济有效的方法，生产工艺简单、原料廉价，且成本低、环境友好、生产周期短、产品纯度较高等优点，目前已成为核黄素工业化生产的主要方法。

目前生产上应用的产核黄素菌株产氨棒杆菌(Corynebactia aminogensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、棉囊阿舒霉(Ashbya gossypii)、无名假丝酵母(Candida famata)及阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbya)等菌株多是通过多轮理化诱变之后筛选到的，由于随机诱变引入突变点的不确定性，这些生产菌株往往具有比较复杂的遗传背景，使得通过代谢工程进一步合理改进这些工业菌株面临着较大的挑战。大量未知突变的存在也使得对进一步合理改进的解释和评估变得更为复杂了。另外，随机诱变使得高产菌株在逐渐积累和目标产品高产相关的正突变的过程中也不可避免的积累了一些不利突变点以及一些与目标表型无关的突变点。枯草芽孢杆菌中核黄素的生产和菌体的生长是相偶联的，在稳定期核黄素已不再积累。然而在棉囊阿舒霉中，核黄素的生产是在稳定期不再与生产关联，但在指数生长期没有积累核黄素。无名假丝酵母相较于丝状真菌更容易放大培养，用于工业生产的无名假丝酵母dep8菌株也是相当不稳定的。它们大都在菌体生长速度、底物利用种类、遗传稳定性等方面存在缺陷。与这些性状相关的基因型通常非常复杂。

大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计来改进菌种。

经检索，目前未见有使用代谢工程改造的大肠杆菌生产核黄素的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能高效率地生产核黄素的大肠杆菌菌株。

本发明的第二个目的是提供一种生产核黄素的大肠杆菌菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种生产核黄素的大肠杆菌菌株的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种生产核黄素的大肠杆菌菌株构建方法，包括如下步骤：

（1）设计以SEQ ID NO.37所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO.38所示的核糖体结合位点RBS2、以SEQ ID NO.39所示的核糖体结合位点RBS3、以SEQ ID NO.40所示的核糖体结合位点RBS4和以SEQ ID NO.41所示的核糖体结合位点RBS5；

（2）分别将所述RBS1和基因ribA连接成片段1、将RBS2和基因ribB连接成片段2、将RBS3和基因ribD连接成片段3、将RBS4和基因ribE连接成片段4、将RBS5和基因ribC连接成片段5；

（3）将步骤（2）所获得的片段1、片段2、片段3、片段4和片段5通过重叠-延伸PCR依次连接并酶切连接到质粒pTrc99a得到质粒p20C-EC10；转入大肠杆菌Escherichia coli MG1655，得到菌株命名为RF01S；