[发明专利]一种海马活性糖蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于-40℃下冷冻干燥48-72h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO₂超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；

（2）海马糖蛋白提取：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0～0.25mol/L的浸提液按（10～35）g：1mL的比例混合于锥形瓶中摇匀后，首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30℃～80℃下浸提1～6h后，用滤纸过滤，得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液；

（3）海马糖蛋白粗纯化：将步骤（2）得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，脱蛋白一次，4℃静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液，进行乙醇分级沉淀，然后将沉淀收集，将沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品。

2.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的CO₂超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为：载气为高纯度CO₂，萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58℃、分离釜温度80℃、CO₂流量15L/h，其中萃取时间依次由动态萃取10min和静态萃取125min组成。

3.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的超声波辅助提取的条件为：超声功率500W，超声时间20min。

4.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的浸提液中NaCl浓度为0.08mol/L，所述的浸提温度为72.77℃，所述的浸提时间为4.27h，所述的脱脂海马粉与所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g：1mL。

5.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的Sevage法除游离蛋白的条件为：糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1，所述的Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成。

6.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的乙醇分级沉淀条件为：将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。

7.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤（3）得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化的过程为：取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g：5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45μm滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。