[发明专利]含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体及其腺病毒和应用

说明书

技术领域

本发明属于表达系统领域，具体涉及含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体及其腺病毒和应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是一种存在于细菌和古细菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来的核酸或噬菌体，并在自身基因组中CRISPR位点留下能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA，用以保护细菌和古细菌不受病毒的侵害。当含有CRISPR/Cas9系统的细菌和古细菌感染病毒后，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶，由于CRISPR相关酶属于核酸酶，能切割病毒DNA分子，从而阻止病毒复制。自2013年以后，研究者们在《Science》、《Nature Biotechnology》等杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。但是，目前CRISPR/Cas9相关的实验对象都局限在细胞水平的操作，例如，细胞系或者单细胞胚胎等，并未将CRISPR/Cas9基因靶向操作技术直接用于活体动物。

腺病毒载体法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一。载体容易构建和操作，宿主范围广，感染性强，腺病毒载体能有效地将外源基因转移到各种靶细胞或组织中。可经不同途径进入不同组织，能感染分化后的非分裂期细胞，并且腺病毒基因不整合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险，外源基因能游离地表达。近年，腺病毒载体引起了科研人员的关注，广泛用于遗传病、传染病和肿瘤等疾病的基因治疗的研究和应用。但是并未用于某些基因进行准确的修饰。如：镰刀形人类遗传病的镰刀形贫血症，是由于血红素S的异常造成的。正常表达血红素S蛋白基因的一个碱基T(胸腺嘧啶)突变为A(鸟嘌呤)，导致血红素S蛋白中的一个谷氨酸突变为缬氨酸。红血球由正常的圆盘状的细胞变异成新月形细胞的一种遗传性疾病。患者会因为红血球功能异常及坏损而导致血液循环不良及剧烈疼痛。我们发明的腺病毒介导的CRISPR/Cas9基因靶向操作系统可以真对动物体的基因组进行靶向修饰操作，那么对于像人类由于基因突变带来的疾病的治疗，例如肿瘤、镰刀形贫血症、白化病等，将会获得突破性的进展。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体；本发明的目的之二在于提供含靶向敲除载体的腺病毒；本发明的目的之三在于提供靶向敲除载体的在制备诱导基因突变试剂中的应用；本发明的目的之四在于提供靶向敲除载体在制备肿瘤抑制剂中的应用。

1、含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体，所述靶向敲除载体由pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒用EcoRI和SacII酶切、补平后连接经BstXI酶切、补平的pAdTrack-CMV质粒，然后用BbsI线性化后连入目的基因的特异靶序列，再用PmeⅠ线性化和CIAP碱性磷酸酶去磷酸化后与pAdEasy-1质粒重组而得。

优选的，所述目的基因为GFP或c-myc基因。

优选的，目的基因为GFP的特异靶序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.7所示。

优选的，目的基因为c-myc基因的特异靶序列如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.18所示。其中作用于SEQ ID NO.12所示特异靶序列的核苷酸为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14退火形成的双链，作用于SEQ ID NO.15所示靶序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17脱火形成的双链，作用于SEQ ID NO.18所示靶序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20退火形成的双链。

更优选的，所述特异靶序列如SEQ ID NO.12所示。

2、含有所述靶向敲除载体的腺病毒。

3、所述靶向敲除载体在制备突变特异靶序列的试剂中的应用。

4、所述靶向敲除载体在制备抑制肿瘤的试剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体及其腺病毒和应用，该靶向敲除载体能够在靶序列区域突变基因序列，且敲除率高，达30.6％-45.8％，因此该靶向敲除载体能够用于基因定点突变，可以用于基因治疗，为临床上基因治疗疾病奠定了基础。

附图说明