[发明专利]一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法

说明书

技术领域

本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种烟草青枯病抗性的鉴定方法。

 

背景技术

由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al)引起的烟草青枯病是一种世界性土传细菌性病害，极具破坏性，并成为制约烟草生产的主要病害。烟草青枯病在主要产烟省区均普遍发生。该病害是典型的维管束病害，烟草根、茎、叶各部位均可被侵染，但主要危害植物的根和茎，其主要症状之一是叶片单边萎蔫和过早变黄。目前，培育和应用抗病品种是防治青枯病最有效的途径。但在抗病育种相关研究中，需要快速、准确地评价大量材料的抗性表现。常用的鉴定方法有：1）漂浮/盆栽烟苗人工接种鉴定法。该方法培养温度不稳定，容易受环境温度变化的影响；病原菌浓度易受育苗池中水的体积及烟盆浇水等因素的影响；近而影响烟苗的发病率和病情指数，影响烟苗抗性水平的鉴定，鉴定结果不稳定，重复性不高。该方法所需空间大，需要搭建温室大棚、育苗池，需要购买加热装置，管理成本高，需要人力成本高。该方法通量小，一次可以鉴定的品种较少。此外，该方法在鉴定期容易受其它病害的影响，如：烟草黑胫病、猝倒病、灰霉病、病毒病、白粉病等，这些病害会影响烟苗的抗性鉴定结果。2）大田病圃人工接种方法。该方法可以较好地反应品种的抗性；但该方法鉴定周期长、每年只能鉴定一次、所需病圃面积大、用于鉴定的烟草材料有限、青枯菌菌悬液需求量大、发病不均匀，且存在供试材料的抗性表现在年份间和地点间存在差异等问题。盆栽、漂浮烟苗和大田抗性鉴定环境温度难以控制。盆栽和大田抗性鉴定中病原菌数量难以控制。为了更好地筛选青枯病抗源、培育抗病品种、挖掘抗病基因，及研究病原宿主互作机制等，亟需建立一套简便、快速和高效的烟草青枯病抗性鉴定方法。

  

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供一种能高通量、高效率鉴定烟草青枯病抗性，且一次可以鉴定的烤烟品种多的高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法。

本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明公开了的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，包括以下步骤：

（1）培育无菌烟苗

将粒度为2-4mm的石英砂于121℃高温下灭菌30分钟，冷却后将其播入无菌12孔细胞培养板中，每孔10g石英砂，每孔加入4ml无菌水；将待测烤烟种子播种于12孔细胞培养板的石英砂上，播种后将12孔细胞培养板置于25℃、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替条件下培养；

（2）烟苗的日常管理

待烟种发芽后，无菌条件下向培养烟苗的12孔微孔板内添加霍格兰（Hoglangd）营养液，每孔2ml，继续置于25℃、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替条件下培养，待烟苗5-6叶期时用于抗病性鉴定；

（3）接种液制备及接种

将烟草青枯菌(Ralstonia solanacearum)菌株使用前在劳尔氏菌选择性培养基（SMSA）上活化48h，挑典型单菌落至劳尔氏菌选择性培养基（SMSA）平板上，30℃培养48h。将菌苔刮下，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB）培养液，30℃震荡培养36至48h；培养液于4000×g离心20min收集菌体，用无菌水配成菌悬液，调整菌的浓度为1×10⁸cfu/mL，按照0.5 ml/孔将菌悬液添加至12孔细胞培养板的微孔中；

（4）病情调查与分级

接菌后20d调查发病情况，以后每隔3d调查一次发病情况；记录发病率及病情指数，以感病对照发病率达到80%左右的病情指数作为品种抗性评价标准。

上述的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋白胨固体培养基（NA）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂16g，水1000ml，pH 6.8～7.2。

上述的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH 6.8～7.2。

上述的一种高通量鉴定烟草青枯病抗性的方法，其中：SMSA培养基:蛋白胨10g，甘油5mL，水解酪蛋白氨基酸1g，调pH至7.0，加水配至1L，加琼脂粉16g；使用时待溶化好的培养基冷却至50℃左右时每250ml培养基加入1%多粘菌素B 2.5ml、1%结晶紫125μL、1%TTC 1.25ml、1%杆菌肽625μL、0.1%青霉素125μL、1%氯霉素125μL。