[发明专利]蜡状芽孢杆菌ZJB-11071及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株产脱卤酶的菌株——蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJB-11071，及其在生物催化合成环氧化物和手性药物中间体中的应用。

(二)背景技术

1948年Heppel等首先描述了由微生物产生的能使二氯甲烷水解成甲醛的脱卤酶，此后不同类型的脱卤酶被相继发现。1960年Janssen把能从卤族有机化合物上使卤族离子释放出来的酶统称作脱卤酶(Dehalogenase)。从1968年Castro等首次发现以2,3-二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌(Flavobaterium sp.)菌株至今，人们相继筛选到多种可以降解卤代醇的微生物。其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)AD1和节杆菌(Arthrobacter sp.)AD2以及从土壤中获得的棒状杆菌(Corynebacterium sp.)N-1074等。虽然它们降解有机卤化物的途径虽然存在明显差异，但是卤代醇脱卤酶作为关键酶之一，催化碳卤键的断裂存在于所有的代谢途径中。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种能够产生卤醇脱卤酶的菌株——蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJB-11071，及其在生物催化合成环氧化物和手性药物中间体中的应用。

本发明采用的技术方案是：

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJB-11071，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M2013314，保藏日期2013年7月5日。该菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得，经检测具有催化合成环氧化物和手性药物中间体(R(-)4-氰基-3-羟基丁酸乙酯)的性能。

本发明还涉及所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-11071在微生物催化卤代醇制备环氧化物中的应用，所述的应用为：以蜡状芽孢杆菌ZJB-11071经发酵培养后的湿菌体为催化剂，以卤代醇为底物，于pH值为7.0～7.5的缓冲液中，在35℃、150rpm条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化反应液用乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相即为含有环氧化物的混合液，将混合液分离纯化，获得所述环氧化物。

所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为30～80g/L，优选50g/L，所述底物的初始浓度为20～50mmol/L。

所述卤代醇为1,3-二氯-2-丙醇、2,3-二氯-2-丙醇或1,3-二溴-2-丙醇。

本发明还涉及所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-11071在生物催化合成手性药物中间体中的应用，所述的应用为：以蜡状芽孢杆菌ZJB-11071经发酵培养后的湿菌体为催化剂，以S(-)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，于pH值为7.0～7.5的缓冲液中，在35℃下进行转化反应，转化反应结束后，将转化反应液用乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相，将混合液分离纯化，获得R(-)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯；所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为50g/L，所述底物的初始浓度为20～50mmol/L。

本发明所述湿菌体按如下方法制备：

(1)斜面培养

将蜡状芽孢杆菌ZJB-11071接种至斜面培养基，在30℃培养12h，获得斜面菌体；

所述斜面培养基终浓度组成为：NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0；

(2)种子培养

从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl10.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶剂为水，pH值为7.0；

(3)发酵培养

将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h后，在12000g下离心5min，收集湿菌体；