[发明专利]一种副猪嗜血杆菌试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种检测副猪嗜血杆菌5型试纸条,包括依次连接固定于PVC板上的由吸水材料构成的样品垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，以及位于硝酸纤维素膜上且相互分开的检测线和质控线，其特征在于胶体金垫包被的抗原是副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白，检测线是副猪嗜血杆菌5型全菌抗原，质控线是副猪嗜血杆菌全菌抗原的多抗IgG。

2.权利要求1所述的副猪嗜血杆菌试纸条制备方法，其特征在于：

a. 用副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白包被胶体金，制备出胶体金；

b. 在PVC条上依次固定吸水材料构成的样品垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜、吸收垫

c. 取副猪嗜血杆菌5型全菌抗原，经过超声波破碎，反复冻融之后3000转/分钟离心10分钟，取上清在硝酸纤维膜上制备检测线；

d，用得到的副猪嗜血杆菌5型全菌抗原多抗IgG, 在硝酸纤维膜上制备检测线；

e. 按要求切割得到副猪嗜血杆菌试纸条。

3.根据权利要求2所述的副猪嗜血杆菌试纸条制备方法，其特征在于抗原结合金标垫的pH值为7.0，且在抗原结合的过程中需要加入18% BSA 50ul/ml、1%PEG 20000 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，离心后的重悬液其配方为：0.02M四硼酸钠、0.5% BSA、5%蔗糖、0.05%吐温20，重悬后铺金，37℃干燥1小时，然后进行试纸条的组装。

4.权利要求2或3所述的副猪嗜血杆菌试纸条所用的制备方法，其特征在于副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白是以副猪嗜血杆菌DNA为模板，以SEQ ID №1和SEQ ID №2为引物进行PCR扩增，将经纯化的PCR产物连接入pMD18-T simple vector，再按常规方法转化DH5α感受态细，经酶切后阳性重组质粒命名为为pMD-OppA，分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pMD-OppA与pET-30a-c(+)载体，酶切后经琼脂糖凝胶电泳，切下所需的目的条带，回收纯化目的片段和载体片段，用T4 ligase连接，再将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中得到阳性重组质粒命名为pET-30a-OppA，再将重组表达质粒pET-30a-OppA转化大肠杆菌BL21得到DE3-HPS-OppA工程菌种，DE3-HPS-OppA工程菌诱导表达后层析柱纯化后得到副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白。