[发明专利]基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物。 

背景技术

大豆镰刀菌根腐病主要危害大豆根系，影响作物对水分和养分的吸收。此病的发生可使大豆植株的根活性、根重、根瘤重、固氮酶活性以及侧根数等均受到不同程度的影响，最早是由Crommell在1917年报道于美国。据调查病害该病可使大豆一般减产10％‐30％，严重时可达60％。现已知该病分布于中国、美国、印度、日本及菲律宾等国，是严重影响我国东北和黄淮海地区大豆生产的重要病害，在黑龙江省三江平原尤为严重。 

大豆镰刀菌根腐病可由多种镰孢菌侵染引起，迄今中国已报道的镰孢菌有尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、茄腐镰孢菌(F.solani)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、燕麦镰孢菌(F.aveneum)、半裸镰孢菌(F.semitectum)等。本发明针对大豆禾谷镰孢菌的分子检测进行了一系列的研究。 

传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，将菌种鉴定到纲、目、科、属、种。然而真菌的形态特征复杂，且有些菌类形态特征和生理生化特征随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。 

随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为真菌的分类鉴定提供了技术条件。同工酶分析、RFLP、PFGE、RAPD以及DNA序列分析等技术为研究真菌的遗传变异提供了有利的手段。应用特导性的引物PCR扩增真菌DNA是一种较常规技术，具有灵敏度高、快速的特点。 

目前用于检测大豆禾谷镰孢菌的方法有PCR，Real‐time PCR，分子标记等，虽然这些方法在特异性和灵敏度上有较大的提高，但是需要依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。 

环介导等温扩增技术(Loop‐mediated isothermal amplification,LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可 以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。 

此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过加入SYBR Green I观察颜色和荧光变化便可直接判断结果，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中大豆禾谷镰孢菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测大豆禾谷镰孢菌的问题，而提供了大豆禾谷镰孢菌新的分子检测方法，对大豆禾谷镰孢菌进行LAMP检测，检测周期短(仅需1h)、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

SEQ ID NO.1所示的大豆禾谷镰孢菌CYP51c基因序列作为靶标在LAMP检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。 

用于检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物，由SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。 

本发明所述的引物组合物在检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。 

本发明所述的引物组合物在制备大豆禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂中的应用。 

一种检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，含有本发明所述的引物组合物。