[发明专利]一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法

说明书

技术领域

一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，属于分析测定技术领域。

背景技术

半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）是一类重要的非蛋白巯基化合物，因化合物结构上含有的巯基（-SH）使Cys和GSH在重金属解毒中发挥着重要的作用。马蔺（Iris lactea var. chinensis）为多年生宿根草本，具有适应性广、抗性强、生物量大、栽培管理粗放等特性，目前已被广泛应用于园林绿化、盐碱地改良、水土保持、重金属污染土壤修复等方面。马蔺对重金属具有较强的积累和耐受能力，其中重金属胁迫下非蛋白巯基Cys和GSH的大量合成是其解毒的重要机制。目前，Cys和GSH的测定方法有紫外法，薄层色谱法，高效液相色谱法（HPLC），毛细管电泳法，气相色谱法以及气质、液质联用等。紫外法由于样品中伴随着其他巯基化合物的存在，Cys、GSH和其他巯基化合物在相同波长下均有较强的吸收，因此测定值一般偏高；而薄层色谱法在分离效果、速度、定量准确度等方面存在缺陷；高效液相色谱法仍是目前应用最为广泛的一种检测方法，但利用HPLC检测植物Cys和GSH仍存在因检测时间过长而导致流动相消耗量大、检测物质易变性等缺点。孙琴（土壤Cd、Zn复合污染对小麦根系植物络合素和谷胱甘肽合成的影响，孙琴，王超，农业环境科学学报，2008年第5期）报道，小麦根系Cys和GSH单个样品检测时间长达70min，进样量需要50ul。而利用超高效液相色谱（UPLC）可快速高效的测定植物中Cys和GSH含量，目前利用UPLC检测植物体内Cys和GSH国内外还未见报道。

发明内容

技术问题

本发明为解决现有的Cys和GSH测定方法存在成本高、检测时间长等问题，提供了一种利用超高效液相色谱仪对马蔺Cys和GSH含量进行快速高效定性、定量分析的方法。

技术方案

一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，利用超高效液相色谱快速高效的对马蔺Cys和GSH同时进行定性和定量分析：

（1）标准溶液配置

分别精确称取所述半胱氨酸和谷胱甘肽各0.1g，用1ml 0.1%的TFA溶解，作为标准贮备液，-20℃保存备用；使用前，根据实验需要将此标准贮备液用0.1%的TFA稀释至适宜含量，以配制标准工作液和混合标准工作液；

（2）Cys和GSH提取样品经过0.45μm滤膜过滤，用于进行检测分析；

（3）超高效液相色谱分离检测条件：

所述超高效液相色谱分析是指通过流动相梯度洗脱，进行波长检测，洗脱和检测条件为：

色谱柱：Vydac C18色谱柱或同类UPLC反相C18色谱柱。

流动相：流动相A 为0.1%的TFA，流动相 B 为 100 %ACN。

洗脱程序：12%～25% B（3min）、25%～100% B（0.5min）；洗柱：100% B（1.5min）；柱平衡：100%～0% B（0.5min）和柱后流动时间：1.5 min。

流速：0.3～0.8 ml·min^-1，优选0.5ml·min^-1。

柱温：25～35℃，优选30℃。

进样量：1～2μl，优选1μl，以峰面积进行外标法定量。

荧光检测器条件为：λ_ex（激发波长）380nm、λ_em（发射波长）470 nm。

紫外检测器的选择：选用二极管阵列检测器。

（4）定性

对Cys和GSH混合标准品进行色谱检测，得到标准品色谱图；对植物样品进行色谱检测，得到植物样品中Cys和GSH的UPLC色谱图；通过增高法进行定性分折；

（5）定量

制作标准曲线：准确配制1～100 ng·µl^-1的五个不同浓度的Cys和GSH的混合标样，按照上述液谱条件进样，进样量为1µl；以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到2条标准曲线；定量：每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。

有益效果