[发明专利]单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

对于单细胞转录组测序来说，转录组测序文库的构建是主要的难点，因为单细胞中mRNA含量低至10pg，无法通过常规的RNA转录组文库的构建方法来构建。因此，目前市场上能够利用如此少量的mRNA进行单细胞转录组测序文库构建的产品一般在获得预扩增cDNA后采用Illumina公司的DNA文库构建试剂盒(illumina Nextera XT DNA sample preparation kit)。

Illumina公司的该试剂盒是采用化学方法对样品进行片段化，即用转座酶对cDNA进行打断的方式建库。单细胞经裂解后，mRNA经反转录得到cDNA，然后对cDNA进行预扩增后，采用转座酶打断的方式对cDNA进行片段化处理。于此同时，转座酶在打断的同时会在破碎片段的两端加上接头，然后再经PCR对片段进行富集，该步骤中PCR的引物会在破碎片段的两端带上标签序列(index)，加标签序列的目的是给不同的样品带上不同的标签，以便从得到的混合测序数据中分离出各样品所对应的测序数据。Illumina公司的上述DNA文库构建试剂盒具有能从低至1ng的样品起始量进行文库构建的巨大优势，但采用上述试剂盒所构建的测序文库存在插入峰很宽的问题，大约在300bp～1000bp之间。文库峰宽的宽窄会对上机定量的准确性产生影响，进而影响上机量和产出。文库峰宽越宽，定量的偏差就越大。因而存在文库上机定量的不准，数据量产出不稳定的问题。因为如果是数据产出过量，浪费成本；如果产量不足，还需要后期额外加测，耽误项目周期。

为了克服上述缺陷，现有技术中采用物理破碎的方式对反转得到的cDNA进行打断，使破碎片段较小且相对均匀，进而使得所构建的单细胞转录组测序文库的峰宽较为集中；且片段化后的样品不经纯化步骤减少了样品损失不仅能够实现微量样品的单细胞转录组测序文库的构建，而且还能增加数据量产出的稳定性，从而提高了大规模单细胞转录组文库高通量测序的可靠性。

但在打断之前都需要经过预扩增的步骤，以使cDNA的量能够满足建库所需，然而这种物理破碎的方式对cDNA进行打断，会使得所构建的文库中含有预扩增的引物污染，约占数据总量的20％，造成数据的浪费。

因此，仍需要对现有的单细胞转录组测序文库的构建方法进行改进，以减少所构建的文库中的预扩增引物污染。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用，用以减少所构建的文库中的预扩增引物污染片段。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种单细胞转录组测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：直接对单细胞的RNA进行反转录得到cDNA；用扩增引物对cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA；对扩增cDNA进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，扩增引物中的dTTP替换为dUTP。

进一步地，对cDNA进行片段化文库构建的步骤包括：步骤S1，对cDNA采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2，对片段化不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3，对修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；步骤S4，对带接头样品进行扩增，得到单细胞的转录组测序文库。

进一步地，在得到带接头样品之后，以及对带接头样品进行扩增之前，还包括对带接头样品进行消化的步骤，消化步骤中用ESUR酶进行消化。

进一步地，物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA进行片段化；优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA进行片段化时的参数设置为：循环数8％～12％，峰值入射功率170～180瓦；循环数/爆发200～220个；时间300～360s；温度4～8℃。

进一步地，自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA进行片段化后得到的片段化样品的长度为150～200bp。

进一步地，在得到片段化样品之后，以及对片段化样品进行末端修复的步骤之前，还包括对片段化样品进行浓缩的步骤；优选采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNASpeed111V离心浓缩系统。