[发明专利]腈水合酶及其编码基因和应用有效

专利信息
申请号: 201410621651.2 申请日: 2014-11-06
公开(公告)号: CN104450657B 公开(公告)日: 2017-10-03
发明(设计)人: 杨立荣;郭法谋;王丽燕;吴坚平;徐刚 申请(专利权)人: 浙江大学
主分类号: C12N9/88 分类号: C12N9/88;C07K14/00;C12N15/60;C12N15/63;C12P13/02
代理公司: 杭州天勤知识产权代理有限公司33224 代理人: 胡红娟
地址: 310027 浙*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 水合 及其 编码 基因 应用
【说明书】:

技术领域

本发明涉及基因工程领域,尤其涉及一种腈水合酶及其编码基因和应用。

背景技术

腈是一类重要的化合物,它的水解反应被广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成,在有机合成中占有及其重要的地位。腈水解的方法主要有化学水解法和生物转化法,与化学水解法相比生物转化法具有条件温和、环境污染小、并能实现化学、区域和对映体选择性等优点。生物转化法主要涉及腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。其中腈水合酶可以催化腈水合生成酰胺,酰胺酶进一步将酰胺催化水解生成羧酸化合物,而腈水解酶可以直接催化腈生成酰胺化合物。

产腈水合酶微生物的分布是相当广泛的,如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺的工业化生产中,如专利号为US007405064B2的专利公开了一种野生睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D;专利号ZL88106735的专利公开了一种野生玫瑰色红球菌J-1;专利号为ZL86100062的专利公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌;专利号为ZL99106291.4的专利公开了一种野生嗜热假诺卡氏菌JCM3095;专利号为ZL03115536.7的专利公开了一种野生丙酸棒杆菌。

目前,利用微生物法生产丙烯酰胺、烟酰胺的方法主要从菌株的筛选和驯化以及生产工艺的建立和改造等方面开展工作。但是,其中普遍存在野生菌种的酶活稳定性差、对底物和产物的耐受性不高、产品质量不够稳定等问题,同时在野生菌株中除腈水合酶外,还存在酰胺酶和腈水解酶,其可以造成副产物烟酸和丙烯酸的生成,从而严重影响烟酰胺和丙烯酰胺的产量和质量,同时增加分离纯化的难度和生产成本。

随着生物技术的迅速发展,人们认识到用基因工程技术手段来构造具有腈水合酶活性的基因工程菌株可以用来解决上述的难题。用基因工程菌来表达腈水合酶有许多野生菌所不具有的优点,如可以单独克隆表达腈水合酶,阻断催化反应过程中副反应的发生,不会使酰胺在产生的同时又有部分被降解,从而提高产品的产量和质量;另外基因工程菌的适应性强、发酵周期短,有利于实现大规模培养和工业化生产。当前,重组腈水合酶的研究已经引起人们广泛的重视,经过众多科研工作者的多年努力也取得了相当多的成就,但是还存在着诸多问题,如酶的表达水平低、热稳定性不高、对底物和产物的耐受性差,这严重制约了腈水合酶的工业化应用。

发明内容

本发明提供了一种高表达量、高活性且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。

一种腈水合酶,由α亚基和β亚基组成,所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。该腈水合酶的命名为NHaseK。

本发明还提供了一种编码所述的腈水合酶的基因。

优选的,所述的基因包含碱基序列如SEQ ID NO.1所示的编码α亚基的基因和如SEQ ID NO.2所示的编码β亚基的基因。该碱基序列来源于产酸克雷伯菌KCTC 1686(Klebsiella oxytoca KCTC 1686),由1278个碱基组成。自5’端第1位到609位碱基编码腈水合酶α亚基;自5’端第625位到1278位碱基编码腈水合酶β亚基。进一步,碱基序列如SEQ ID NO.7所示。

所述的基因还包含编码腈水合酶激活子的碱基序列。所述腈水合酶激活子的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。为提高表达活性,所述基因经过修饰后连接有激活子的基因(SEQ ID NO.3)。进一步地,碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还公开了一种腈水合酶激活子,氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还公开了一种任一所述基因的表达盒、重组载体和转化子。

本发明又公开了一种所述的腈水合酶在制备酰胺化合物中的应用。

由于氨基酸序列的特殊性,任何含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体,只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上,且具有相同的酶活力,均可实现本发明目的,属于本发明保护范围之列。

由于核苷酸序列的特殊性,任何含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示多核苷酸的变体,只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性,均可实现本发明目的,属于本发明保护范围之列。

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