[发明专利]一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法。

本发明得到的菌株已于2013年9月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，编号：CCTCC M 2013422，分类名称耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2)。

背景技术

L-酪氨酸是一种芳香族氨基酸，属于条件必须氨基酸，适量补充酪氨酸可刺激大脑神经，改善记忆力，还可辅助改善焦虑、烦躁等情绪，增强身体抵抗力。此外，L-酪氨酸还是合成L-多巴和黑色素的主要原料，L-多巴是临床上治疗帕金森氏病的常用药物。传统的L-酪氨酸合成法是采用酸、碱或酶对含蛋白质的原料进行水解，但随着环境问题的出现及资源的短缺，许多学者开始关注通过微生物发酵来制备L-酪氨酸(Hagino H,Nakayama K.L-Tyrosine production by analogresistant mutants derived from a phenylalanine auxotroph of Corynebacterium glutamicum[J].Agricultural and Biological Chemistry,1973,39:2013-2023.Ito H,Sakurai S,Tanaka T.Genetic breeding of L-tyrosine producer Brevibacterium lactofermentum[J].Agricultural and Biological Chemistry.1990.54:699-705)。本发明人研究发现，花椒内生耐寒短杆菌属Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2013422)液体发酵产物经Sephadex LH-20层析柱初步分离，高效液相色谱(HPLC)分析后，对发酵产物进行进一步的分离纯化，并采用电喷雾电离质谱(ESI-MS)及核磁共振(NMR)等方法鉴定出发酵产物中含有L-酪氨酸。

目前，未见从花椒内生耐寒短杆菌发酵产物中分离制备L-酪氨酸的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法。

本发明的目的由以下技术措施实现：

从花椒内生耐寒短杆菌发酵液中制备L-酪氨酸的方法包括以下步骤：

(1)微生物菌种及培养基

菌种：由中国典型培养物保藏中心保藏的一株花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)菌株，培养条件为划线接种到斜面培养基上，于温度30℃恒温培养箱中培养24h后，将获得的菌落接种一个单菌落到150mL发酵培养基中，在温度28～37℃下，120～180r/min的水浴恒温振荡器上振荡培养24～72h。

耐寒短杆菌斜面培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，初始pH值7.2～7.4。

发酵培养基为：1％可溶性淀粉，3.5％黄豆粉，1％NaCl，初始pH值7.0。

(2)发酵生产

用上述菌种及培养方法将花椒内生耐寒短杆菌属GH-HJZ2(Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2，保藏编号为：CCTCC M2013422)发酵获得发酵液。

(3)发酵产物预处理

将上述发酵液用低速离心机在常温下以4000～6000r/min的速度离心15min后除去菌体，然后收集上清液，真空冷冻干燥后备用；

(4)Sephadex LH-20柱分离

将上述发酵液过Sephadex LH-20层析柱，按样品与Sephadex LH-20质量比1:20～50的比例上样，上样量为柱体积的20％；用100mL纯水进行等梯度洗脱，洗脱流速为2～6mL/min；按每份收集量20mL等份收集洗脱液，编号F₁～F₅备用；

(5)物质纯化