[发明专利]一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法

权利要求书

1.一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法，其特征是在于

以重组菌株全细胞为生物催化剂，并在该全细胞体系中添加底物4-羟基肉桂酸，实现细胞内催化反应制备4-羟基肉桂醛；

所用的底物4-羟基肉桂酸选用香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，浓度为1mM；

重组菌的构建

提取基因组的毛白杨为741毛白杨；

为了获得4CL1-CCR的完整序列，我们以4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL1）和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）的全长cDNA质粒载体作为PCR扩增反应模板；利用引物2和引物3的重叠区域进行多重PCR实验，以及含有SphⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物1和含有KpnⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物4进行PCR反应扩增双功能酶基因片段：

引物1：5’-ggcatgcatgaatccacaagaagaattc-3’，

引物2：5’-gatgaagcatcaaccggcatagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccagaaccaccaccacctatgcctgccaacttttctttcag-3’，

引物3：5’-atgccggttgatgcttcatcactttcag-3’，

引物4：5’-gggtaccttattgaatcttcacagactcttc-3’，

循环利用PCR产物与PMD18-T载体相连，获得重组PMD18-T4CL1-CCR；PCR扩增的保真度通过DNA测序分析；扩增产物利用SphⅠ和KpnⅠ进行酶切，然后插入空载体pQE31的同一位点上，构建重组质粒pQE31-4CL1-CCR，转入大肠杆菌构建重组菌株E.coliM15/pQE31-4CL1-CCR；该重组菌株具有催化4-羟基肉桂酸还原为4-羟基肉桂醛的能力；

所述双功能酶的核苷酸序列为序列表中所示；

重组菌株全细胞的制备

LB固体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；LB液体培养基，以g/L计，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，琼脂粉15，pH7.5，氨苄青霉素0.1，卡那霉素0.025；

将含有双功能酶基因的重组菌株pQE31-4CL1-CCR的大肠杆菌M15接种于LB固体培养基，活化；挑取重组菌株单菌落接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200rpm振荡培养至控制OD600为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.4mmol/L,于28°C、200rpm诱导培养8h；

重组菌株全细胞催化生产4-羟基肉桂醛由50mL反应体系组成：50mL含重组菌株全细胞的LB液体培养基，终浓度为1mM的底物4-羟基肉桂酸；反应混合物于37°C、200rpm避光振荡反应2-32h,反应后混合物用等体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；

产物通过高效液相色谱串联质谱法进行分析；反相高效液相色谱柱为ZORBAX 300SB-C18柱（2.1× 150 mm， 3.5 μm; Agilent，Santa Clara， CA，USA），流动相为乙腈，流速0. 10~0.15 mL/min，检测波长为325 nm；质谱为配备ESI源的离子阱质谱（LCQ DECA XP MAX）。