[发明专利]一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物转化方法制备植物次生代谢产物。

背景技术

4-羟基肉桂醛是木质素生物合成及降解过程中重要的中间代谢产物，包括香豆醛、咖啡醛、松柏醛和芥子醛。4-羟基肉桂醛是农业化学、植物科学以及生物能源领域的研究热点之一。这类芳香族聚合物阻止了木质纤维素类生物质转化为液态燃料，因此是生物燃料生产、反刍动物对纤维素的消化利用和制浆造纸等工农业生产中经济利用木质纤维素的最大障碍之一。4-羟基肉桂醛不仅是木质素单体生物合成的关键中间体，也是木质素人工合成及天然合成过程中的重要代谢产物。有趣的是，缺乏肉桂醛脱氢酶的植物比正常植物催化4-羟基肉桂醛还原为单体的能力提高了50%。4-羟基肉桂醛同时也是多种植物次生代谢物生物合成的假设中间体，其中包括一些重要的植物代谢调控物以及许多生物医学研究的热点。另外，4-羟基肉桂醛是4-羟基肉桂醇及其衍生物的重要合成前体，包括木质化的潜在单体替代物。

4-羟基肉桂醛的研究对于探究与其相关的生物合成和加工过程十分必要，是调控木质化过程和开发可用于液态生物燃料发电的木质纤维素类生物质至关重要的一步。尽管松柏醛和芥子醛可以在市面上买到，香豆醛和咖啡醛目前尚未作为商品供应。目前合成4-羟基肉桂醛的方法包括利用4-乙酰基苯甲醛的维蒂希反应、肉桂酸氯化物和混合酸酐的还原反应、以及苯丙烯醇的氧化反应等化学方法合成。但利用化学合成法生产制备4-羟基肉桂醛存在操作步骤繁琐、产率低、副产物多和难于纯化等问题。

生物转化是利用完整的生物有机体作为催化剂进行化学转化的过程，其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化。细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应，弥补了酶法催化中级联催化过程不易实现的不足，同时又省去了繁杂的酶的分离纯化过程。大肠杆菌是生产植物次生代谢产物的良好系统，包括通过苯丙烷途径生产植物化学物质。但是，尚没有利用重组双功能酶菌株催化生产4-羟基肉桂醛的报道。构建重组菌株的基因来自741毛白杨，该双功能酶基因编码4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL1）和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR），催化4-羟基肉桂酸还原为4-羟基肉桂醛。

发明内容

本发明针对现有4-羟基肉桂醛制备工艺上的不足，目的在于提供一种4-羟基肉桂醛的方法。该种全细胞酶制剂制备方法简单，不涉及到酶的分离纯化。这种全细胞酶制剂具有转化效率高，性能稳定的特点。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种重组菌株及其全细胞催化生产4-羟基肉桂醛的方法，特征是在于以重组菌株全细胞为生物催化剂，并在该全细胞体系中添加底物4-羟基肉桂酸，实现细胞内催化反应制备4-羟基肉桂醛；

所用的底物4-羟基肉桂酸选用香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，浓度为1mM；

（1）   重组菌的构建

提取基因组的毛白杨为741毛白杨。

为了获得4CL1-CCR的完整序列，我们以4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL1）和肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）的全长cDNA质粒载体作为PCR扩增反应模板。利用引物2和引物3的重叠区域进行多重PCR实验，以及含有SphⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物1和含有KpnⅠ限制性酶切位点（下划线）的引物4进行PCR反应扩增双功能酶基因片段：

引物1：5’-ggcatgcatgaatccacaagaagaattc-3’，

引物2：5’-gatgaagcatcaaccggcatagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccagaaccaccaccacctatgcctgccaacttttctttcag-3’，

引物3：5’-atgccggttgatgcttcatcactttcag-3’，

引物4：5’-gggtaccttattgaatcttcacagactcttc-3’，

利用PCR产物与PMD18-T载体相连，获得重组PMD18-T4CL1-CCR。PCR扩增的保真度通过DNA测序分析。扩增产物利用SphⅠ和KpnⅠ进行酶切，然后插入空载体pQE31的同一位点上，构建重组质粒pQE31-4CL1-CCR（见图1），转入大肠杆菌构建重组菌株E.coli M15/pQE31-4CL1-CCR。该重组菌株具有催化4-羟基肉桂酸还原为4-羟基肉桂醛的能力。

所述双功能酶的核苷酸序列为序列表中所示。

（2）重组菌株全细胞的制备