[发明专利]SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒及方法。

背景技术

硒是一种人类和动物必需的微量元素，与许多疾病密切相关，如癌症、神经退行性疾病及心血管病等，并在一些重大疾病的防治中起到重要作用。

在现有已发现的25种硒蛋白中，硒蛋白K(SelK)是2003年被Gladyshv实验室鉴定出的一种新型硒蛋白；SelK是一个含有94个核苷酸，大小为10.6KD的小分子蛋白。关于SelK的生物学功能尚不明确，近几年发现SelK可能有如下功能：SelK在心肌细胞中参与应对氧化应激；在人肝癌细胞中参与调节内质网应激；在受体介导的免疫细胞活化过程中促进钙流；参与内质网相关蛋白降解；参与调节巨噬细胞表面CD36棕榈酰化；影响泡沫细胞的形成和动脉粥样化等。因此硒蛋白K的表达水平对于多种生命活动中的症状诊断具有非常重要的参考价值。

而现有对于SelK表达水平的检测方法中，多通过传统的蛋白质染色印迹或者荧光定量PCR的方法进行。其中，荧光定量PCR可以快速实时的监测并计算模版的初始浓度，为研究蛋白在转录水平上的表达提供了便捷的一种方法。而现有的荧光定量PCR中的染料法是属于非特异性的检测方法，不如荧光探针法对模版没有特异性；同时，现有荧光探针法的引物和探针多只适用于某一特定的局部组织或者细胞，在其他的组织细胞检测中经常扩增不到目的条带，使用中存在不足。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种适用于各种人的细胞或组织鉴定SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒及方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒，包括特异性引物和荧光探针；其中，

所述特异性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物R；

所述荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且5’端标记有可淬灭的报告基团，3’标记有BHQ荧光基团。

采用本专利中的引物探针可以成功扩增出目的基因，扩增曲线良好，电泳结果显示目的条带清晰；且引物探针反应性能良好，适用于各种人的细胞或组织鉴定SelK的表达。

本发明进一步还提出一种采用上述试剂盒进行SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

提取待测样本RNA；

将所述待测样本RNA进行反转录，得到反转录DNA；

以所述反转录DNA为模板，进行实时荧光PCR；

检测PCR过程中的荧光信号；

其中，所述实时荧光PCR过程中采用的引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的下游引物R；

所述实时荧光PCR过程中采用的荧光探针具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列，且5’端标记有可淬灭的报告基团，3’标记有BHQ荧光基团。

本发明的上述检测方法，实时反映靶基因扩增的过程，并根据内参或外参直接反映出靶基因的拷贝数；具有灵敏度高、特异性强等优点；并且引物和探针基于硒蛋白表达的mRNA的特定的区域设计，适用于各种人的细胞或组织鉴定SelK的表达。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测的荧光变化图；

图2为本发明实施例SelK基因表达水平的荧光定量PCR扩增产物的电泳结果图；

图3为图1中荧光荧光曲线对应的扩增样本和统计数据图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种SelK基因表达水平的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

S10，获取待测样本，并提取待测样本的RNA；

S20，以提取的待测样本的RNA模板进行实时荧光RT-PCR；

S30，RT-PCR过程中的荧光信号。