[发明专利]热稳定的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白寡聚物及其在免疫组合物中的用途

说明书

发明领域

本发明涉及医药特别是疫苗的领域，并且更具体地，涉及可用于疫苗以针对呼吸道合胞病毒(RSV)进行免疫的重组蛋白。

发明背景

人呼吸道合胞病毒(hRSV)导致急性上呼吸道和下呼吸道感染，并且是婴儿在出生第一年中住院治疗的主要原因。RSV的再感染频繁发生并且消除性免疫从未稳固地建立。RSV还在老年人中导致显著的疾病负担和死亡率，这堪比流感。

hRSV是属于副粘液病毒科(Paramyxoviridae)的肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)的包膜负链RNA病毒。该亚科的其它成员为牛RSV(bRSV)和人偏肺病毒(hMPV)。hRSV颗粒含有两个主要的糖蛋白(其是中和抗体的主要靶标)：附着蛋白G和融合蛋白F(综述于CollinsPLandJAMelero.2011.Progressinunderstandingandcontrollingrespiratorysyncytialvirus:stillcrazyafteralltheseyears.VirusRes162:80-99)。存在两种RSV血清型(A和B)，它们在其G蛋白中相比于F蛋白更为不同。F蛋白相较于G蛋白似乎是更有效的中和及保护性抗原。这可能与G蛋白的高碳水化合物含量相关，所述碳水化合物可保护蛋白不被免疫识别。此外，G蛋白还从被感染的细胞分泌，在该形式下其可用作抗原诱饵。F蛋白不仅用于使病毒和宿主膜融合，还在病毒-细胞附着中起着主要作用。因此靶向F的中和抗体可干扰病毒-细胞附着和/或病毒-细胞融合。

RSVF蛋白是I型膜蛋白，其被合成为组装成三聚体的无活性前体蛋白(命名为‘F0’)。重组野生型RSVF编码基因的核苷酸序列提供为SEQIDNO：1，而编码的重组可溶性野生型蛋白序列提供为SEQIDNO：2。该前体蛋白在其运输通过分泌途径期间通过弗林蛋白酶样蛋白酶切割为名为‘F2’、‘p27’和‘F1’的形式。F2和F1的同源三聚体(其通过二硫键共价连接)形成亚稳定融合前活性结构。F1含有七肽重复区A和B(称作为HRA和HRB)、融合肽(FP)和跨膜(TM)结构域，后两者位于该分子的相对侧。在病毒-细胞附着后，RSVF蛋白中的构象变化导致疏水性融合肽至宿主细胞膜中的插入。随后，该融合中间体重折叠成高度稳定的融合后结构。该后一种结构的组装由六螺旋束(6HB)的组装决定。此6HB包含反向平行构象的各单体的HRA和HRB，其结果是位于HRB下游的跨膜结构域和位于HRA上游的融合肽被定位在相邻位置并实现病毒和宿主膜的融合。研究已阐明了F蛋白以其融合后构象的结构(McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96；SwansonKA等人2011.ProcNatlAcadSciUSA108:9619-24)。最近，还阐明了F蛋白以其融合前构象的结构(McLellan等人，2013Science340(6136):1113-7)。为了将F稳定在其所需的构象，将该蛋白与融合前特异性中和抗体D25共表达(US2012/0070446)。共晶体结构显示，D25结合至三聚体顶端上被指定为抗原位点0的位点(图2)。D25与F的融合前形式的结合区包括SEQIDNO：2所示的野生型RSVF蛋白序列的氨基酸60-71(F2区)和氨基酸197-210(F1区)。这些区域分别对应于如McLellan等人，April2013.StructureofRSVfusionglycoproteintrimerboundtoaprefusion-specificneutralizingantibody.Science340:1113-7中的图3所述的氨基酸63-74和200-213。电子显微镜和竞争结合表明，AM22(US2012/0070446)结合相同的抗原位点。