[发明专利]一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测

说明书

技术领域

本发明涉及核酸的检测方法，特别是一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测。

背景技术

现知人类的疾病都与基因有着直接或间接的关系，p53基因是人体重要的抑癌基因，使癌细胞自杀，防止癌变，还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。一旦p53基因发生突变，将会加快肿瘤的生长和癌症的发展。因此，对核酸的高灵敏、高选择性的快速检测方法存在着越来越迫切的需求，这对于基因研究、药物筛选以及临床诊断都有现实意义。

目前，用来检测核酸的方法主要有：DNA印迹、RNA印迹和PCR技术，这些方法操作中的一个共同点是必须把未杂交的探针和引物与杂交体分离后才能借助其他信号对靶核酸进行准确定量检测。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测，所述的电化学传感器具有很高的灵敏性，而且免标记。

本发明的另一目的还在于提供一种快速、高灵敏度的核酸检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，技术方案如下：

(1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，形成连接探针1-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物，其中，连接探针1的核苷酸序列为5’-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3’，如序列表中SEQ ID NO.1所示，捕获探针的核苷酸序列为5'-SH-C6-AAA GGG TTG GGC GGG ATG GGT TGA GTC TTC C↓AG TGT GAT GAA ACC CAT C-3'，如序列表中SEQ ID NO.2所示；

(2)石墨烯分散在壳聚糖溶液中，形成壳聚糖-石墨烯聚合物，即CS-GR复合物；

(3)在基底电极表面修饰CS-GR复合物，得壳聚糖-石墨烯/基底电极，即CS-GR/基底电极；

(4)将壳聚糖-石墨烯/基底电极处理后，浸在连接探针2中，得连接探针2/壳聚糖-石墨烯/基底电极，即S2/CS-GR/基底电极，其中，连接探针2的核苷酸序列为5’-NH₂-C6-TTT TTTTCT GAC GCT GCT CAC G-3’，如序列表中SEQ ID NO.3所示；

(5)将S2/CS-GR/基底电极浸在S1-CP-AuNPs聚合物中，通过S1和S2间碱基互补配对将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底电极上，制得连接探针1-捕获探针-金纳米粒子/连接探针2/壳聚糖-石墨烯/基底电极，即传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。

所述步骤(2)中壳聚糖溶液的质量分数为0.1wt％～0.5wt％。

优选地，所述步骤(3)中，基底电极为玻碳电极。

所述步骤(1)中连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，连接探针1和捕获探针中分别加入三(2-氯乙基)磷酸酯TCEP，室温避光处理1小时；将上述两溶液混合加入到金纳米粒子中，室温避光搅拌；搅拌的过程中逐滴加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl，再逐滴加入NaCl溶液，室温避光搅拌；将上述溶液离心，将沉淀重新分散在Tris-HCl和NaCl的混合溶液中，即得连接探针-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物。

所述步骤(3)中，玻碳电极用三氧化二铝粉打磨成镜面后清洗，晾干后，将CS-GR复合物滴涂在玻碳电极上，室温晾干，制得壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即CS-GR/GCE。

所述步骤(4)中，壳聚糖-石墨烯/玻碳电极浸在戊二醛溶液中，然后清洗；将清洗后的壳聚糖-石墨烯/玻碳电极浸在连接探针S2中，制得连接探针/壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即S2/CS-GR/GCE；其中，戊二醛溶液的质量分数为1.5％～5％。

步骤(3)中所述清洗，是在二次水中清洗3～5分钟，然后依次在乙醇和二次水中超声3～5分钟。

步骤(4)中所述清洗，是分别在NaOH溶液和10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中。

本发明还提供了一种根据上述方案制备的免标记电化学传感器。

本发明的另一目的是提供上述电化学传感器在检测核酸含量的应用，包括以下步骤：