[发明专利]一种小麦种子高分子量谷蛋白亚基检测样品的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小麦种子高分子量谷蛋白亚基检测样品的制备方法，属于谷物化学领域，专用于小麦谷蛋白的化学提取。

背景技术

高分子量麦谷蛋白亚基(High molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)对小麦面筋质量具有决定性作用(Gianibelli等，2001)，由Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1三个位点上的6个基因编码，但多数品种具有3～5个HMW-GS。发掘和聚合优质HMW-GS是国内外小麦品质育种最重要的途径，因此如何快速进行HMW-GS的提取和鉴定，直接影响小麦面筋品质分子育种的成效。

由于HMW-GS对面筋强度的影响存在加性效应和互作效应，因此在涉及2-3个HMW-GS杂交转育的育种方案中必须同时跟踪多个亚基。单个基因的聚合酶链式反应(PCR)或多个基因的多重PCR检测可在小麦育种世代的苗期检测，但存在两个问题，一是苗期检测无法观察到小麦单株的农艺性状，对那些农艺性状较差的单株在苗期大规模检测势必浪费人力物力；多重PCR同时还存在本身反应体系不稳定，加之显性标记稳定性差等因素，在一般小麦育种单位的实用性仍不足。另外，HMW-GS的PCR检测一般根据每个位点x型和y型亚基两个编码基因紧密连锁的特征，仅对其中的一个亚基基因进行标记检测，对部分HMW-GS缺失突变系无法检测。亦有利用芯片的方法对HMW-GS进行鉴定(Jondiko等，2012)，但设备和日常耗材昂贵。HMW-GS为显性表达，传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可同时检测所有的HMW-GS在当代小麦胚乳中的表达及组成，且可在灌浆期或成熟期进行，不仅避开了小麦生长的农忙期，而且已对目标单株进行了优选，仍是当前最有效实用的方法。但是该方法检测效率较低，主要原因是样品提取繁琐，在分子育种实际工作中实用性较差。因此，建立一套高效低耗的样品制备方法显得尤为重要。

目前用于SDS-PAGE检测的小麦种子HMW-GS提取主要过程为粉碎、化学还原和烷基化三步。育种早代样品可通过小型磨磨制全麦粉(刘丽等，2004)、也可取单粒或半粒种子经锤击或碾压粉碎，这两种方法都需要保证无样品间相互污染，样品准备过程仍较为繁琐。化学还原剂通常选用二硫苏糖醇、β-巯基乙醇，浓度范围为1％-2％；烷基化通常选用4-乙烯吡啶，浓度在1％左右。化学还原剂和烷基化试剂的溶剂和缓冲液通常有50％正丙醇、或含有正丙醇和SDS的Tris-HCl溶液(晏月明等，1998；Jondiko等，2012；刘丽等，2004)。已有的这些提取方法都是在1.5mL或2.0mL离心管中，利用50mg左右样品在100uL-300uL提取系统中完成，需要针对每个样品单独提取，在种子碾碎、离心管准备、加液、离心和取上清液过程中花费大量的时间，较为繁琐。每人每日正常仅可对100个左右的样品进行提取，工作效率低，工作强度大，难以满足品质育种中的大规模检测。

本发明利用容积为200uL的普通96孔PCR扩增用微孔板和高通量组织研磨器，并将样品提取试剂进行复配，1组可完成2板192个样品的提取，每人每日可完成3组6板576个样品的提取，操作简单，工作强度低。相关的方法仍未见报道。参考文献：

1、刘丽,周阳,何中虎,阎俊,张艳,Pena R J.Glu-1和Glu-3等位变异对小麦加工品质的影响.作物学报,2004,30(10):959-968

2、晏月明,刘广田,Prodanovic S.小麦谷蛋白亚基的凝胶电泳分离及其品种鉴定.中国粮油学报,1998,13(6):1-5

3、Jondiko T O,Alviola N J,Hays D B,Ibrahim A,Tilley M,Awika J M.Effect of high-molecular-weight glutenin subunit allelic composition on wheat flour tortilla quality.Cereal Chem,2012,89:155–161

4、Gianibelli M C,Larroque O R,MacRitchie F.Biochemical,genetic,molecular characterization ofwheat glutenin and its component subunits.Cereal Chem,2001,78:635–646.

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