[发明专利]利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程与生物化学技术领域，特别涉及一种利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法。

背景技术

茶饮料作为一种全球流行的植物饮料，其在抗癌和心血管等疾病的保健功效已经得到公认。目前认为，儿茶素是茶叶中的主要功能活性成分，含量占茶多酚总量的60～80％，包括表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子酸(GA)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)。茶叶中EGCG含量最高，占到茶叶干重的9～13％。茶多酚具有许多重要的保健功效，有很强的抗氧化活性和清除自由基的能力、抑制肿瘤细胞生长的抗癌作用、抗菌抗病毒活性和抑制脂肪积累的减肥功效等。

普洱茶作为一种后发酵茶，通过微生物发酵，茶叶儿茶素成分通过生物转化，形成独特的品质特性和功能特性。在普洱茶发酵过程中，儿茶素含量下降，EGCG和ECG等酯型儿茶素被完全降解，但普洱茶仍然表现出较强的抗癌、抗菌和降血脂降胆固醇等保健功效，说明普洱茶品质形成过程中，儿茶素被微生物分解转化形成了新的功能性成分。事实上，喝茶后，茶多酚在消化道上段不能被分解利用，同时也很少被吸收。绝大多数茶多酚(超过90％)进入到结肠，被结肠微生物所分解后再被结肠吸收，然后进入系统循环起作用，一部分则被排出体外。因此，茶多酚的低生物可利用度与其功能特性形成悖论。如何提高茶多酚的生物可利用度近年来已成为业界关注的热点。Macedo,JA et al研究发现，采用丹宁酶转化茶多酚和EGCG后其抗氧化活性和抗癌活性均有明显的增强。茶多酚体外转化将在结肠中微生物的消化分解转移到体外进行，相当于延长的动物消化道，可大大提高茶多酚的生物可利用度。

茶多酚体外转化可选择酶转化的方式。东华大学采用米曲霉ATCC 20719菌株和黑曲霉ATCC 46890菌株制备表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)水解酶对EGCG进行降解获得表没食子酸儿茶素(EGC)和没食子酸(GA)，两种菌株制备酶液发酵过程均需要48-120h，米曲霉获得的酶液需在40℃的反应体系中，处理24h完成转化，而黑曲霉获得的酶液需要在25-60℃，反应0-48h或直至水解反应结束方可停止。酶转化成本较高，需购买酶制剂或自己制备酶液，工艺复杂。为降低成本，可直接采用微生物全细胞进行生物转化，从发表的文献来看，采用黑曲霉发酵转化EGCG酶转化效率最高为发酵时间为5d。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，采用黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株进行全细胞生物转化，全细胞生物转化的营养液为含有茶多酚或EGCG质量百分含量1～20％的营养液。

所述的黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。

所述的黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株具有以下生物学特性：菌落表面平坦，边缘整齐，培养基背面呈乳白色，中间稍有乳黄色，基内菌丝发达。在25℃的察氏平板培养基上培养8d，RAF106菌落直径为51.0±1.53mm，边缘有少量白色绒毛状气生菌丝，菌落表面呈灰褐色，表面有小滴状黑色渗透液(见图2)。菌落形态不规则，表面褶皱状，培养基背面呈黑褐色。

黑曲霉RAF106菌株rDNA-ITS全长碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的黑曲霉RAF106菌株应用种子培养基进行种子培养，获得黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子；

所述的种子培养基的配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。黑曲霉RAF106菌株的种子培养基也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基。

所述的种子培养的条件为：茄子瓶静置培养，培养温度28～35℃，培养时间3～5d。

在所述的种子培养过程中，黑曲霉RAF106菌株的种子菌接种量为每毫升全细胞生物转化的营养液接种10²～10⁸个黑曲霉RAF106菌株分生孢子。