[发明专利]葡萄枝条RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及葡萄枝条RNA的提取方法。

背景技术

获得完整性好、纯度高的总RNA是开展葡萄功能基因的克隆、分子表达机理和生物信息学研究的前提。植物RNA提取方法主要有CTAB法、SDS法、氯化锂沉淀法、异硫氰酸胍法、Trizol法、Bizol法等。由于葡萄组织结构的特殊性及组织中多糖、多酚等物质含量较高，用这些方法很难提取到高质量的RNA。

葡萄枝条是研究葡萄抗逆性和生长发育规律的重要材料，从枝条韧皮部和形成层提取RNA是目前葡萄分子生物学研究的一个重要方面。近年来，商业化RNA 提取试剂盒在一些植物样品RNA 提取中已被证明具有简单快捷、试验重复性较好的优点，但在葡萄枝条中很难提取到高质量的RNA，甚至提取不到葡萄RNA。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，利用CTAB对葡萄细胞裂解效果好的特点，从抑制提取过程中组多酚物质的氧化褐变、利用2-丁氧乙醇除去多糖等方面着手，提供了一种葡萄枝条RNA的提取方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：葡萄枝条RNA的提取方法，包括以下步骤：

1）称取0.2g葡萄韧皮部与形成层混合样置入研钵中，加入聚乙烯吡咯烷酮固体粉末0.02 g后，迅速倒入液氮进行充分研磨，然后将粉末转入2 ml离心管中，加入预热至65℃的2 % CTAB提取液700 μl和20℃的β-巯基乙醇20μl，颠倒混匀后，在65℃金属浴30min，每隔5 min取出涡旋混匀1次；

2）取出步骤1）得到的涡旋混匀后的离心管放在冰上，迅速加入5M 醋酸钾溶液300μl和2-丁氧乙醇300μl，涡旋振荡，混匀后在-20 ℃条件下静置30min；

3）在步骤2）得到的静置后离心管中，加入200 μl CHCl₃，4℃、15000rpm离心10 min；

4）将步骤3）得到的离心液，取上清，加入800 μl CHCl₃，4℃、12000rpm 离心10 min；

5）将步骤4）得到的离心液，取上清，并加入吸取的上清液体积1.5 倍的-20℃预冷的异丙醇，在冰浴条件下放置30 min；

6）将步骤5）中得到的冰浴后的混合液，在4℃、12000 rpm 离心10 min，弃上清，沉淀用-20℃预冷的75 %乙醇漂洗一次；

7）将步骤6）得到的漂洗后溶液，在4℃、5000 rpm离心3 min，弃上清，在超净工作台上，将离心管倒置在无菌滤纸上吸干管壁内液体后，在超净台上风干2min；

8）在步骤7）得到的风干后离心管中，加DEPC-H₂O 50 μl溶解，-80℃保存备用。

本发明所用主要试剂的配制：

① 1.0M Tris-HCl：称取12.1g Tris碱溶于80 ml DEPC水中，用4.2 ml盐酸浓盐酸调节pH为8.0，用DEPC水定容至100 ml，灭菌备用。

② 5M KAc溶液：称取49.07g醋酸钾固体，加入40 ml DEPC水充分溶解后，加入5 ml冰乙酸调节pH为5.8，用DEPC水定容至100 ml。

③ 0.5M EDTA溶液：称取18.61g Na₂-EDTA·2H₂O，加80 ml DEPC水充分溶解后，加入约3.3g NaOH颗粒调节pH为8.0，用DEPC水定容至100 ml，灭菌备用。

④ 2%CTAB提取液：称取2g CTAB固体，加入10ml 1.0M Tris-HCl、5ml 0.5M EDTA、11.7g NaCl，充分溶解后用DEPC水定容至100ml，灭菌后使用。

本发明的有益效果为：本发明提供的葡萄枝条RNA的提取方法，是利用CTAB对葡萄细胞裂解效果好的特点，从抑制提取过程中组多酚物质的氧化褐变、利用2-丁氧乙醇除去多糖等方面着手，建立的葡萄枝条RNA的高效提取方法，此方法获得了高质量的RNA，可以满足葡萄SSH分析、转录组测序、生物信息学分析等对RNA质量的要求。

经本发明提取方法提取的RNA，具有以下优点：

① 经过紫外分光光度法检测表明，所提取RNA的A260 /A280在2. 0左右, 说明RNA 的纯度较高。