[发明专利]一类丙烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及非病毒基因载体及制备方法。

技术背景

基因治疗是通过向靶细胞或组织引入外源基因DNA或RNA片段，来纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病，其中癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。在基因治疗发展的几十年里，全世界启动了近2000例基因转染的基因治疗临床试验。1990年美国国立卫生研究院的Culver等首次将基因治疗应用到临床试验，采用基因治疗方法对腺苷脱氨酶(ADA)缺陷症进行治疗并取得了成功。2000年，法国成功采用基因治疗技术治愈联合免疫缺陷综合症(X-SCID)，从此证实了基因治疗策略的有效性。但是基因治疗要得到进一步的发展，必须克服三个方面的难题：一、要有用于治疗的目的基因和接受目的基因的细胞；二、实现基因表达的可调控性；三、获得具有靶向性的高效低毒的基因载体系统。其中，具有靶向性高效的基因载体系统，成为制约基因治疗发展的瓶颈之一。

阳离子脂质体具有类细胞结构和生物膜的特性，在体内可降解，可以保护其运载基因片段的生物活性，是一种有临床应用潜力的非病毒基因转染载体。脂质体的这种结构可以包裹药物粉末或压缩基因形成复合物，递送至病变组织或细胞，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。自从1987年Felgner等首次利用N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)对COS-7等细胞进行成功转染后，脂质体已经发展成为除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法，特别在肿瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多。但由于其仍存在一定的局限性，如细胞毒性大，对器官的靶向性不明显，基因转运机制不明确等限制了其广泛应用。因此，人们一直致力于对阳离子脂质体的各种构建及化学修饰，试图寻求一种高效低毒的基因治疗载体。

脂质体发展的近30年来，从广泛使用的季铵盐头部、胍基头部到多胺头部阳离子脂质，已经形成了比较完善的脂质体载体系统，但这些载体系统仍然存在许多问题，如介导基因的转运效率还有待提高；对靶组织无定向识别性；阳离子脂质体/DNA复合物进入细胞后，核酸被束缚于内涵体中，释放困难，不利于在细胞质或细胞核中表达，从而无法达到治疗目的。中国专利CN103553970A，2014-02-05公开了一类氨基甲酸酯型阳离子脂质的制备及其在药物或基因转运中的应用，该载体虽具有高效的基因转运能力，但由于具有季铵盐头部结构而存在一定的细胞毒性，因此在体内基因转运方面受到了限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一类细胞毒性小，在体外基因转染效率高的丙烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用。

本发明的技术方案为：

一、一类丙烷基阳离子肽脂质及制备方法

1、一类丙烷基阳离子肽脂质，其化学结构由通式I表示：

其中：

R₁选自C_1-20烷基，最优选C₁₂、C₁₄、C₁₆或C₁₈；

x选自1～6，最优选2～4；

AA选自Lys、Orn、Arg、His、Asp、Ala或Gly。

2、一类丙烷基阳离子肽脂质的合成方法，它是以氨基保护的氨基酸制备肽头部中间体；将已氨基保护的3-氨基-1,2-丙二醇用酰化试剂酰化后与烷基胺反应，制备双长碳链中间体；将制备的肽头部中间体与制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接；将保护基团脱掉，再与氨基保护的氨基酸进行反应，脱保护后得到所述丙烷基阳离子肽脂质化合物。

具体步骤如下：

(1)利用正交保护法，采用保护试剂保护氨基酸的氨基，制备氨基酸头部中间体：所述氨基酸为赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸或精氨酸。所述保护试剂为Boc₂O、Fmoc-OSu或CbzCl等，所述保护试剂与氨基酸摩尔比为1:1～8:1，反应溶剂为乙腈、水、四氢呋喃、甲苯、丙酮或上述溶剂的混合物等，反应时间为1～20h，反应温度为0～100℃。反应后旋蒸掉溶剂，进行重结晶提纯，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂(v/v＝3:1)。