[发明专利]线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的标志物及其应用

说明书

发明领域

本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的标志物及其应用。

背景技术

不孕不育一直是生殖健康领域亟待解决的重大科学问题。在我国约有9％的育龄夫妇面临此种困境。由于我国人口基数大，育龄夫妇数量尤为可观，新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万。不孕不育症的病因很多，其中由男方因素引起的约占50％。WHO不育症防治专题组的研究表明，生殖内分泌功能紊乱，特别是弱精症是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。

弱精子症(asthenospermia)是指精液参数中前向运动的精子(a和b级)小于50％或a级运动的精子小于25％的病症。而严重弱精子症是指b级+c级精子数量<30％，其中a级精子为零。大量研究表明，弱精子症(特别是严重弱精子症)会导致受孕几率显著降低，同时还会引起流产、早产、输精管阻塞等一系列危害。

目前，弱精子症的诊断方法主要依靠病史询问、体格检查、精液参数、精浆生化、血性激素检测、B超以及染色体检测等。常规的精子活力分析目前主要依靠计算机辅助精子分析(Computer-aidedspermanalysis,CASA)，尚无其他更为有效的手段，但其自身存在一定的缺陷，即精液参数的检测易受到禁欲天数、温度、采集精液方法等因素的影响，从而造成精子活力测量不准确；对相应疾病的早期诊断效果也远不能满足需要。尽管目前国内外研究者正努力探索新的弱精子症诊断生物标志物，并对现有评估手段进行有效的补充，但一直难以突破传统生物标志物发展和男性生殖实际应用中的瓶颈，即精液质量分析结果波动、早期诊断困难等。此外，由于病因不明，缺乏有效的治疗手段，大多数弱精子症病人只能选择ICSI或AID等辅助生育手段，不仅无法满足心理上的需求，而且有可能出现后代的遗传缺陷。

目前认为，导致弱精子症的病因主要有：生殖道感染、免疫因素、精索静脉曲张、先天性疾病等。其发病机制主要包括两方面：(1)由遗传或先天因素导致的精子鞭毛超微结构的损伤；(2)由氧化应激、代谢紊乱、抗精子抗体等引起的精子ATP合成减少，活力退化。

线粒体(mitochondria)作为“能量工厂”，参与维持多种细胞功能，是细胞发挥功能所需能量的主要来源。ATP是精子活力的首要能量来源，它主要来自两个途径：线粒体的有氧氧化和胞质的无氧酵解。经典的理论认为精子中段线粒体形成的线粒体鞘在精子运动过程中提供所需能量，一切影响ATP生成的因素，如呼吸酶抑制剂等均可直接或间接影响精子活力。精子获能以后代谢活动明显增强，提示精子线粒体中氧化磷酸化产生大量ATP，使得精子出现一种特异的“鞭打样”运动方式，通过此种运动方式，精子穿过卵子透明带而受精。由此可见，当线粒体功能出现损伤时，将会影响ATP的产生，也必将影响精子活力，导致生育障碍。

微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与生物的许多正常生理活动密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。在人类中已发现了2000余种miRNAs，目前，预测miRNA至少能调控数千个人类基因，占所有基因的30％以上。miRNA不编码蛋白质，而是以单链形式与辅酶因子TRBP及PACT形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，再与mRNA的3’端非编码区(3’UTR)结合，从而发挥其调控mRNA转录与蛋白翻译的总开关作用。miRNA在其5’端有一个2-7个碱基组成的互补区，通过与靶mRNA的3’UTR(threeprimeuntranslatedregions)的完全或部分靶向互补结合导致其降解或抑制转录后的翻译。作为21世纪生命科学的重大发现，越来越多的研究显示，其参与的细胞转录后调控，在个体发育、细胞胞增殖、分化、代谢和凋亡等多种生物学过程中发挥着重要的调节作用。有大量文献报道，miRNA在男性生殖细胞的增殖以及晚期精子分化的过程中都发挥着非常关键的作用。研究表明，核编码miRNA可以进入线粒体参与线粒体功能的调节，同时，最新研究发现，线粒体自身基因组也可以编码大量非编码RNA，进而发挥多种生物学功能。这些miRNA被称为线粒体相关miRNA(mitochondria-relatedmiRNA)。