[发明专利]一种用于化学发光共振能量转移的集成化双酶‑量子点制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于化学发光共振能量转移的集成化双酶-量子点制备方法，主要用于化学发光-量子点共振能量转移检测生物分子，进行细胞和组织等成像，属于生物分析领域。

背景技术

量子点通常是由IIB～ⅥA或IIIA～VA元素组成的、直径在1～10 nm的球或类球形半导体纳米粒子。量子点由于其粒径很小，电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能结构，在一定的激发光源下激发会发出荧光。随着生命科学的发展以及人类对健康的追求，纳米科技中的量子点纳米探针在生物学的应用已成为了人们关注的热点。量子点与传统染料相比具有光量子点效率高、激发光谱宽、发射光谱窄，荧光寿命长、颜色可调、抗光漂白等独特的光学性能，用其构建的量子点探针为生物分子的“标识”、“阅读”提供了有效的途径，并已广泛的运用于生命科学的各个领域。目前，对量子点纳米探针的修饰、标记和生物偶联的研发正成为不断促进生命科学发展的重要推动力之一。

化学发光共振能量转移（CRET）在生命分析中已显示了其特有的优势如无需光源、仪器简单、反应设计多样化等，将其与独特光学性能的量子点结合，研究的化学发光共振能量转移量子点（CRET-QDs）探针在生命分析中具有良好的应用前景及实用价值。目前已建立以辣根过氧化物酶（HRP）-鲁米诺-H₂O₂ （Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45: 5140-5143），BrO--鲁米诺（Chem. Eur. J. 2010, 16: 6142-6145）、DNA催化酶-鲁米诺-H₂O₂（J. Am. Chem. Soc. 2011, 133: 11597-11604）化学发光反应为量子点能量供体的体系。然而，这些化学发光体系中一般需加入氧化剂如H₂O₂，会氧化CdSe、ZnS等量子点导致其表面产生缺陷，从而降低其荧光效率甚至产生猝灭；另一方面，鲁米诺与氧化剂反应的背景发光波长范围约在350-580 nm之间，对短荧光波长的量子点探针进行检测时，会造成背景光谱干扰严重，会影响多组分同时检测。

发明内容

本发明的目的在于针对现有化学发光量子点探针的不足，提出制备新型、集成化的双酶-量子点纳米材料。本发明将辣根过氧化物酶（HRP）和氧化酶偶联在量子点上制备集成化的双酶-量子点纳米器件，避免直接加入氧化剂（H₂O₂）且发光反应仅在量子点表面进行、背景低，可用于特异性地检测氧化酶对应的底物分子，多元分析，细胞或组织等的成像。

本发明的技术方案如下：

(1)碲氢化钠的制备:将碲粉、硼氢化钠（NaHB₄）和超纯水于离心管中反应，碲粉全部溶于溶液反应完毕，制备得到碲氢化钠溶液，取出置于低温保存。

(2)通过水热合成法制备不同尺寸的碲化镉量子点:将10mMCdCl₂溶液和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）于三口烧瓶中混合，在N₂氛围下，搅拌反应30 min，调节pH至8.0。移取（1）中的储存液于三口烧瓶中（速度要快并隔绝氧气），搅拌反应10 min， Cd²⁺/Te^2-/NAC的摩尔比为4:1:7。控制反应温度为150℃，反应时间为0.5-2 h，得到发射波长为500-650 nm的碲化镉量子点水溶液；

(3) 制备集成化双酶-量子点: 将 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和量子点于0.01M 的pH为7.4的PBS缓冲溶液中混合均匀，量子点、EDC和NHS的摩尔比为15:1:0.8，活化量子点30 min。称取一定量的辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOD)/胆固醇氧化酶（ChOx），HRP与GO D /ChOx的活性单位比为2:1和30:1，分别用1 mL PBS溶液（pH=7.4）溶解。再将溶解后的HRP溶液加入到活化后的量子点溶液中继续振荡30 min，然后加入溶解后的GOD/ ChOx溶液继续振荡2.5 h。反应后的溶液转移到超滤管中，以10000 r/min的转速离心10 min，将离心管中的上层混合物用1 mL PBS溶液溶解转移到1 mL离心管中低温保存，制备得到双酶-量子点纳米材料。

发明效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：