[发明专利]一种体外提呈、激活DC细胞的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及基于重组技术及多肽合成技术，具体为一种体外提呈、激活DC细胞的方法及其应用。

背景技术

非小细胞肺癌目前是全世界死亡率最高的癌症。除了采用传统的手术、放化疗之外，生物免疫疗法是探索开展的新的治疗手段。

目前生物免疫方法治疗晚期非小细胞癌一般步骤：APC细胞的抗原提呈、T细胞激活、T细胞转运、T细胞进入肿瘤、起效。这五个过程都是在体内进行。临床实践证明，上述五个环节都非常脆弱，尤其是体内的激活过程更是容易受到干扰，是生物治疗的瓶颈。

DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。通过DC细胞免疫治疗来达到靶向治疗的疗效，既往及目前有关特异性细胞免疫治疗的研究及临床应用主要是应用肿瘤抗原来刺激DC细胞，以期获得能直接特异性杀伤肿瘤细胞的DC-CIK细胞。但问题是针对肿瘤的最佳抗原仍未明确，且肿瘤细胞本身及其微环境的免疫抑制仍未解决，因此目前大多数DC-CIK细胞治疗并不能真正实现特异性杀伤肿瘤。

通过DC细胞诱导机体产生抗肿瘤免疫的治疗流程目前有以下两种方法：

1）抽取病人外周血50-60ml——分离单个核细胞，体外诱导DC细胞——DC细胞负载肿瘤抗原，通过静脉回输给病人或经皮下注射——经肿瘤抗原负载DC能刺激自体T细胞——产生强烈的抗肿瘤免疫应答。

2）抽取病人外周血50-60ml——分离单个核细胞，体外诱导DC细胞——DC细胞负载肿瘤抗原并与自体的淋巴细胞混合，刺激自体T细胞产生细胞毒性T淋巴细胞——将这些细胞毒性T淋巴细胞，通过静脉回输给病人——直接杀伤肿瘤细胞。

然而以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。

发明内容

本发明旨在提供一种体外提呈、激活DC细胞的方法，以一种明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，从而能够绕过肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，为实现特异性细胞靶向免疫治疗提供前期体外抗原制备和细胞激活技术。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种体外提呈、激活DC细胞的方法，包括：体外培养诱导生成DC细胞、制备肿瘤抗原、所述肿瘤抗原冲击DC细胞，所述肿瘤抗原表达MAGE-3。

进一步的，所述肿瘤抗原为MAGE-3抗原融合蛋白、MAGE-3病毒疫苗或特异性MAGE-3抗原肽。

关于制备肿瘤抗原方面，进一步的技术方案，所述MAGE-3抗原融合蛋白为HBVc-MAGE-3融合蛋白，HBVc-MAGE-3融合蛋白分子量22.4kD；所述HBVc-MAGE-3融合蛋白的制备步骤包括：构建质粒通过大肠杆菌表达HBVc-MAGE-3融合蛋白、融合蛋白分离纯化和超滤脱盐；所述构建质粒通过大肠杆菌表达HBVc-MAGE-3融合蛋白步骤为：

a、将含HBVc蛋白表达序列的pET-28a质粒，以HindIII限制性内切酶进行酶切，插入序列SEQIDNO：1；

b、NcoI和XhoI双酶切pET-28a质粒，目的基因大小为630bp，酶切后空质粒大小为5.4kb;

c、使用构建好的pET-28a质粒转化大肠杆菌感受态细胞，表达出的融合蛋白HBVc-MAGE-3自动组装成类病毒颗粒。

进一步的技术方案，所述MAGE-3病毒疫苗为rMVA-MAGE-3疫苗，所述rMVA-MAGE-3疫苗的制备方法包括：

a、构建穿梭质粒:A549细胞RNA逆转录获取MAGEA3基因cDNA；将MAGEA3基因cDNA克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中；