[发明专利]一种土壤中残留bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法

权利要求书

1.一种土壤中残留Bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）去除待测土样中的动植物残体，充分研磨，通过50-60目筛子使得土壤粒径在0.2mm以下；

2）将研磨后的土样在高压湿热条件下灭菌15-20分钟；

3）称取灭菌后的土样1-2g，放入10ml离心管中进行清洗去除土壤杂质；

4）对去除过杂质的土壤土样表面进行封闭；

5）对封闭后的土壤土样进行抗体结合检测：

5.1）向封闭后的土样中加入3ml反应液Ⅰ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，50rpm/min，孵育2h，期间每隔20min颠倒离心管数次，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

5.2）加入洗涤液Ⅱ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，100rpm/min，震荡5min；之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

5.3）重复步骤5.2）三到五次；

5.4）加入3ml反应液Ⅱ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，50rpm/min，孵育1h，期间每隔20min颠倒离心管数次，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

5.5）加入洗涤液Ⅱ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，100rpm/min，震荡5min；之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

5.6）重复步骤5.5三到五次；

5.7）加入新鲜配置的3mlTMB显色液，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，100rpm/min，孵育30min，期间每隔10min颠倒离心管数次，孵育结束后加入2M硫酸1ml终止反应，之后10000rpm/min离心5min，取上清液于酶标仪450nm进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种土壤中残留Bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法，其特征在于，所述步骤3）中去除土壤杂质步骤如下：

3.1）加入洗涤液Ⅰ3ml，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，200rpm/min，震荡10min，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

3.2）重复步骤3.1）一次；

3.3）加入洗涤液Ⅱ3ml，充分摇匀后，水平置于摇床，37℃，200rpm/min，震荡5min，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

3.4）重复步骤3.3），直到上清液不再有泡沫。

3.根据权利要求1所述的一种土壤中残留Bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法，其特征在于，所述步骤4）中土样表面进行封闭步骤如下：

4.1）向洗涤后的土样中加入3ml封闭液，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，50rpm/min，孵育1h，期间每隔10min颠倒离心管数次，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

4.2）加入洗涤液Ⅱ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，100rpm/min，震荡5min；之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

4.3）重复步骤4.2）三到五次即可。

4.根据权利要求2所述的一种土壤中残留Bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法，其特征在于，所述洗涤液Ⅰ配方为：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，2%（m/v）SDS，0.2mmol/LEDTA。

5.根据权利要求2所述的一种土壤中残留Bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法，其特征在于，所述洗涤液Ⅱ配方为：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L。

6.根据权利要求3所述的一种土壤中残留Bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法，其特征在于，所述封闭液配方为：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，8%m/vBSA，0.5%v/vTween-20。