[发明专利]一种土壤中残留bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白检测技术领域，具体涉及一种土壤中残留Bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法。

背景技术

近年来，随着转Bt作物种植面积的不断扩大，其对生态环境的潜在风险也日益成为国内外专家和学者研究的热点。转Bt作物在种植以后，在其整个生长期内，会通过根系分泌物、花粉、植物残茬向土壤释放Bt毒素，这些分泌的Bt毒素会被土壤中的粘土矿物和腐殖质等表面活性颗粒吸附，且该结合态毒素仍具有较强的杀虫活性，在土壤环境中可长时间存留。土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤中的动物和微生物种群对于土壤生态系统的物质降解和能量转换起着非常重要的作用。这些残留的毒素可能会对土壤中无脊椎动物、微生物种群产生潜在的毒性，影响土壤动物及微生物种群的多样性结构，从而破坏土壤的物质循环和能量转换。因此，研究转Bt基因植物毒蛋白在土壤中的残留和降解动态对于保护生态环境安全具有十分重要的意义。

目前，对于土壤中残留Bt蛋白的检测方法，主要通过提取液从土壤中提取Bt蛋白后进行ELISA法检测。目前提取土壤中残留Bt蛋白的方法主要有SDS法,碳酸盐法、人造蠕虫肠道蛋白提取液法、PBST试剂盒法等方法。上述这些方法在土壤残留Bt蛋白检测中发挥了一定的作用，但是也都存在一定的缺陷。现有的这些检测土壤bt蛋白的方法，均为先用提取液提取bt蛋白后，再进行检测，该方法操作简单，但是用于土壤这种吸附力很强的介质的时候，往往效果不会很理想，一些牢固吸附在土壤颗粒表面的bt蛋白很难被洗脱下来，因此不能反映土壤中Bt蛋白的真实残留含量。

发明内容

发明目的：本发明针对目前现有土壤Bt蛋白检测方法的弊端，研发出了一种新的直接在土壤颗粒表面进行原位酶联免疫定量检测bt蛋白的方法，该方法可以不经过提取直接精确检测出吸附于土壤颗粒表面的难提取bt蛋白，真实反映出土壤中Bt蛋白的残留情况。同时，结合现有的检测提取液中bt蛋白的方法，两者的数据相加，可以完整的得到土壤中bt蛋白的真实含量。本发明为监测Bt蛋白在土壤中的残留及其对土壤生态系统的影响提供了一条新的途径，而且本方法不仅仅可以用于土壤bt蛋白的检测，在更换不同的抗体后更可以用于检测各种土壤中的残留蛋白含量。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种土壤中残留Bt蛋白的原位酶联免疫定量检测方法，包括以下步骤：

1)去除待测土样中的动植物残体，充分研磨，通过50-60目筛子使得土壤粒径在0.2mm以下；

2)将研磨后的土样在高压湿热条件下灭菌15-20分钟；

3)称取灭菌后的土样1-2g，放入10ml离心管中进行清洗去除土壤杂质；

4)对去除过杂质的土壤土样表面进行封闭；

5)对封闭后的土壤土样进行抗体结合检测：

5.1)向封闭后的土样中加入3ml反应液Ⅰ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，50rpm/min，孵育2h，期间每隔20min颠倒离心管数次，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

5.2)加入洗涤液Ⅱ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，100rpm/min，震荡5min；之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

5.3)重复步骤5.2)三到五次；

5.4)加入3ml反应液Ⅱ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，50rpm/min，孵育1h，期间每隔20min颠倒离心管数次，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

5.5)加入洗涤液Ⅱ，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，100rpm/min，震荡5min；之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

5.6)重复步骤5.5三到五次；

5.7)加入新鲜配置的3mlTMB显色液，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，100rpm/min，孵育30min，期间每隔10min颠倒离心管数次，孵育结束后加入2M硫酸1ml终止反应，之后10000rpm/min离心5min，取上清液于酶标仪450nm进行检测。

其中，上述步骤3)中去除土壤杂质步骤如下：

3.1)加入洗涤液Ⅰ3ml，充分摇匀后，水平置于摇床，室温，200rpm/min，震荡10min，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；

3.2)重复步骤3.1)一次；

3.3)加入洗涤液Ⅱ3ml，充分摇匀后，水平置于摇床，37℃，200rpm/min，震荡5min，之后10000rpm/min离心5min，弃上清液；