[发明专利]维生素D的新应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及维生素D的新应用。

背景技术

中国癌症协会2015年2月15日发布的新数据表明，仅2011年，中国卵巢癌发病人数与死亡人数分别为45,223和18,430人。卵巢表面上皮细胞(OvarianSurfaceEpithelialCell,OSEC)是包被在卵巢表面的一层立方-长方形细胞，位于卵巢韧带和腹膜间皮之间，起源于苗勒氏系统。在卵巢排卵后，起到修复卵巢表面破溃的作用。

按照起源，卵巢癌主要分为三种：1上皮-间质性；2性索-间质性；3生殖细胞肿瘤。目前研究认为，上皮性肿瘤约占所有卵巢肿瘤的60％，其中大约90％的恶性卵巢肿瘤被认为起源于正常的卵巢表面上皮(OvarianSurfaceEpitheliaOSE)细胞。卵巢表面上皮的恶性转化的原因基本可以分为三类，炎症因子的刺激、持续的促性腺激素刺激和持续不断的排卵。如果卵巢表面上皮细胞覆盖在一个不排卵的卵巢上面时它就会处在一个静止的间质状态，而同时具有上皮细胞与间质细胞的特点。当卵巢连续性排卵或者组织重建时，OSE就会发生一个去分化的过程，从上皮细胞向间质细胞转化(EMT)。此过程首次被发现是在胚胎发生时，并被认为是胚胎形成的关键。后来研究发现EMT过程与成人器官纤维化及肿瘤转移有关。有研究证明，EMT参与了卵巢癌发生过程中肿瘤细胞生长、生存、迁移、侵袭及耐药性的调节，并被认为是卵巢癌发展的一个关键性过程。

卵巢癌是一种病死率极高的妇科癌症，这主要与其三个特性有关：一是卵巢癌早期缺少有效的筛查与诊断措施；二是卵巢癌恶性程度高，晚期易发生转移；三是卵巢癌晚期，癌细胞对卡铂和紫杉醇等化疗药物易产生耐药性。卵巢癌极易发生远端转移，早期筛查及诊断率低，而且在晚期对放疗和化疗易产生耐受性，病死率极高，因此，对于卵巢癌的预防性治疗药物的发现迫在眉睫。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种有效减缓卵巢表面上皮恶性转化进程的方法，特别是维生素D在卵巢癌的预防性治疗药物上的新应用。

本发明第一方面涉及一种小鼠卵巢表面上皮细胞(MouseOvarianSurfaceEpithelialCell，MOSEC)体外恶性转化培养方法，包括以下步骤：

1)卵巢表面上皮细胞分离：取6-8周龄未生育过的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，冲洗并剥离残留的输卵管、脂肪组织及卵巢被膜后，利用胰酶消化分离其卵巢表面上皮细胞，然后加入完全培养基以终止胰酶消化过程，离心弃上清液后再次加入选择性完全培养基并移入培养皿中在培养箱中孵育，孵育第2天避免移动培养皿，孵育第3天根据细胞生长情况采用半量换液法更换培养液，当卵巢表面上皮细胞密度达80％时，使用免疫荧光法检测上皮细胞标志物角化蛋白(Pan-keratin)的表达，当其阳性率达95％以上且鹅卵石样立方上皮细胞达80-85％以上时，进行下一步骤；

2)早期传代：接种代数小于15代的卵巢表面上皮细胞，使用半量换液法按2：3至3：2比例传代，传代时间间隔5-7天，培养液采用选择性完全培养基；

3)中期传代：接种代数在16至84代之间的卵巢表面上皮细胞，16-60代按1：2至1:4比例传代，60代后按1：5至1：8比例传代，传代时间间隔为3-5天，培养液采用完全培养基；

4)晚期传代：接种代数大于85的卵巢表面上皮细胞，按1：8至1：10比例传代，传代时间间隔为3-5天，培养液采用部分性完全培养基。

所述选择性完全培养基、完全培养基均为包括胎牛血清(FBS)、mEGF、以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培养液，所述部分性完全培养基为包括胎牛血清、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠且不含mEGF的DMEM/F12培养液；所述选择性完全培养基、完全培养基、部分性完全培养基中胎牛血清的浓度依次增大，所述选择性完全培养基中mEGF的浓度高于完全培养基中mEGF的浓度。

进一步的，接种代数在15代之前的卵巢表面上皮细胞，每次传代时使用胰酶溶液的消化时间为30-45s，所述胰酶溶液中胰酶浓度为0.1％且不含EDTA。

进一步的，所述选择性完全培养基为包括3-4％胎牛血清(FBS)、1-1.2％青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)、8-10ng/mlmEGF、1-1.2％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培养液。