[发明专利]一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒及其扩增引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种寄生虫检测试剂盒，特别涉及一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒及其扩增引物。

背景技术

随着吃海鲜、生鱼片等饮食时尚的兴起和渔业、旅游业的发展，食源性寄生虫病已成为我国的新“富贵病”，我国城镇居民特别是沿海经济发达地区的感染人数呈上升势头。据调查，由于市场开放，鱼类、肉类等食品供应渠道增加，城乡食品卫生监督难以跟上，疫区鱼类、活畜及畜产品大量流入非疫区，加上风行的生、冷猎奇的饮食方式，寄生虫病可能出现在生食生鲜水产品的人群中。因此有必要开展对生鲜水产品中主要食源性寄生虫感染现状调查，并研究寄生虫快速、准确、灵敏的病原鉴别方法，用于规范水产品生产和流通，保障居民餐桌上的鱼虾肉食品安全健康。

华支睾吸虫囊蚴主要存在于淡水鱼种，简单异尖线虫存在于海水鱼种，生鲜淡海水鱼均可能加工成鱼肉，淡海鱼种无法区分，此时直接运用生食，且加工刀具存在互相交叉污染的可能，鱼肉中存在同时感染这两种致病虫种的可能。目前，华支睾吸虫的鉴定方法还没有统一的标准，目前对华支睾吸虫囊蚴的诊断依赖于显微镜检查。众所周知，显微镜检查耗费时间长，检查效率低，对检查者临床工作经验要求较高，而且对于与华支睾吸虫亲缘关系相近的囊蚴，虫卵形态相似，普通光镜无法区分，使用这种方法往往会出现误判。免疫诊断法虽然较显微镜检查法效率高，但也常常为灵敏度和特异性所局限。此外，简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴一般都是分开检测的，耗时长，检测成本高。多重PCR可以同时检测两种病原生物，但传统的多重PCR体系中，由于存在多对引物，引物之间的干扰以及引物与模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题，制约多重PCR技术的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒，不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测两个基因。

本发明还提供了上述检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增引物。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种检测简单异尖线虫和华支睾吸虫囊蚴的双重PCR扩增试剂盒，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，dNTPs0.64mmol/L，简单异尖线虫正向扩增引物0.32μmol/L，简单异尖线虫反向扩增引物0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物0.32μmol/L，华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物0.32μmol/L，简单异尖线虫DNA模板10-24ng/μL，华支睾吸虫囊蚴DNA模板10-24ng/μL，Taq酶1U/μL。

本发明以华支睾吸虫囊蚴和简单异尖线虫的核糖体DNA内转录区(18SrRNA,ITS-1,5.8SrRNA,ITS-2,28SrRNA)序列为目标，专门设计了针对性的两对特异性引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。进一步的设计了检测试剂盒，检测结果特异，结果易判断，灵敏度高，特异性强，检测快速、准确、经济，为华支睾吸虫和简单异尖线虫同时感染的诊治和预防提供有效的技术手段。

作为优选，所述简单异尖线虫正向扩增引物序列为：5'-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3'(SEQIDNO.1)。

作为优选，所述简单异尖线虫反向扩增引物序列为：5'-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3'(SEQIDNO.2)。

作为优选，所述华支睾吸虫囊蚴正向扩增引物序列为：5'-ATGCTCTCGGTATGCTCGCTT-3'(SEQIDNO.3)。

作为优选，所述华支睾吸虫囊蚴反向扩增引物序列为：5'-GTCGTACCCGGGATAAGGCA-3'(SEQIDNO.4)。

作为优选，所述Tris-HCl的pH为8.3。