[发明专利]从皱纹盘鲍鲍鱼内脏中分离的抗炎肽及其用途

说明书

本发明用于评估皱纹盘鲍的有益效果，使用多阶段HPLC纯化系统从鲍鱼中纯化抗炎肽(AAIP，鲍鱼抗炎肽)。在串联MS分析中，碎裂结果阐明，具有一氧化氮(NO)抑制活性(IC₅₀＝55.8μM)的AAIP的氨基酸序列为Pro‑Phe‑Asn‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Ala‑Ser(1175.2Da)。同时还研究了AAIP对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬细胞的抗炎效果并阐释了分子机理。结果表明AAIP肽经由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达以剂量依赖性方式抑制LPS诱发的一氧化氮(NO)生成，还显著地降低了促炎症细胞因子的基因转录，促炎症细胞因子例如白细胞介素(IL‑1β)、肿瘤坏死因子(TNF‑α)和IL‑6。此外，AAIP显著地抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)例如p‑p38和p‑JNK的磷酸化。这些结果表明，AAIP经由阻断巨噬细胞中的MAPK途径而抑制LPS诱发的炎症响应。因此，AAIP可应用于炎症治疗的药物或保健性食品中。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说生物活性肽领域。特别地，本发明涉及使用连续HPLC纯化系统从鲍鱼肠中分离的抗炎肽及其用途。

背景技术

炎症表示允许组织响应于损伤或感染的一组高度协调的事件，其需要各种细胞类型表达的参与和以顺序的方式对各种各样媒介物的反应(SebbanCourtois，2006)。巨噬细胞是先天免疫系统中的主要免疫细胞。当被病原体感染时，巨噬细胞的活化在炎症响应中起着关键的作用。巨噬细胞可以通过吞噬作用直接地杀死病原体和通过分泌各种促炎症媒介物间接地杀死病原体。巨噬细胞在涉及促炎症细胞因子和炎症媒介物的生成过剩的炎性疾病中起着重要的作用，促炎症细胞因子包括白细胞介素(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)，炎症媒介物包括由活化诱导型一氧化氮合酶(iNOS)生成的氧化物(NO)(Lee等人，2006；Walsh，Crotti，Goldring，Gravallese，2005)。NO经由L-精氨酸的末端胍氮的氧化由NOS生成，且涉及炎症和致癌作用(WongBilliar，1995)。因此，通过阻断iNOS表达来抑制NO生成过剩可用于治疗各种炎性病症。

脂多糖(LPS)，是革兰氏阴性菌的主要成分，引起在炎症响应的发病机理中起到关键的作用的许多主要的细胞响应，且已被用于诱导巨噬细胞活化。在用LPS刺激之后，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)还调节关键的促炎症途径。MAPK(ERK 1/2，p38和JNK)是响应于各种阵列的细胞外刺激而被活化且介导从细胞表面到核的信号转导的一组丝氨酸/苏氨酸激酶(CobbGoldsmith，1995)。此外，MAPK先前已经涉及与LPS诱发的炎症相关联的信号通路。已经表明三种主要的MAPK的磷酸化和活化在LPS诱发的巨噬细胞中引起炎症基因表达(Hommes，Peppelenbosch，van Deventer，2004)。LPS处理导致经由MAPK信号通路通过使p38、ERK和JNK磷酸化来调节iNOS的表达，p38、ERK和JNK是MAPK亚科的主要三个不同的组(Cario等人，2000)，被认为在炎性疾病中以不同的性能起着不同的作用。因此，MAPK的参与经常涉及疾病的发生和免疫或炎症响应的表达(InoueKubo，2004)。

生物活性肽是对身体功能或状况具有积极影响且最终可能影响人类健康的特定蛋白片段；其预期由安全、可靠和一致的口服递送系统来提供。肠胃蛋白水解酶帮助在消化之后释放肽，且这些被吸收的组分部分对人来说足以是生理学上活性的。此外，也已报道了源自胃消化液的生物活性肽对抗炎、抗高血压、抗氧化、抗癌、抗菌和抗关节炎方面具有有益效果(Jung，Rajapakse，Kim，2005；Rajapakse，Mendis，Jung，Je，Kim，2005；Ryu，Qian，Kim，2010)。特别地，由于胃消化液肽为生产相当大量的生物活性肽提供了迅速和可再现的方法，胃消化液肽可成为营养制剂中潜在有益的成分(KapsokefalouMiller，1991)。

鲍鱼是海洋腹足动物，它们是亚洲、非洲、澳洲和美洲中大量海上养殖的重要渔业和食物工业资源之一。太平洋鲍鱼，即皱纹盘鲍，已经从二十世纪九十年代在东亚地区大量海上养殖。