[发明专利]一种防止启动子在传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用

权利要求书

1.一种基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

2.含有权利要求1所述基因序列的载体。

3.含有权利要求1所述基因序列的CHO细胞株。

4.权利要求3所述细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

1)将CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将质粒DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育后，将二者混匀，室温孵育；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育；

6)观察转入基因表达情况：取培养液上清，WesternBlot检测蛋白量，能检测到蛋白的为成功转入；

7)稳定转染；

8)优化：将稳定转染的细胞挑出来，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，选出蛋白量较高且三次蛋白量之间相差比较小的细胞；

9)建立稳定细胞株。

5.根据权利要求4所述细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

1)将0.5×10⁵～2×10⁵(个)CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将质粒DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育5分钟后，将二者混合，混匀，室温孵育20分钟；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育4～6h；

6)24～48h后观察转入基因表达情况：取培养液上清，WesternBlot检测蛋白量，能检测到蛋白的为成功转入；

7)稳定转染：每3天以1：10传代1次，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，若第三次的蛋白量是第一次的80％，则表明已稳定转染；

8)优化：将上一步选出的稳定转染的细胞挑出来，每3天以1：10传代1次，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，选出蛋白量较高且三次蛋白量之间相差比较小的细胞；

9)建立稳定细胞株。

6.权利要求1所述的基因序列在防止CHO细胞传代培养中启动子逐渐灭活上的应用。

7.权利要求1所述的基因序列在制备单克隆抗体、提高单克隆抗体产量上的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将权利要求3所述的CHO细胞株加入到培养基中，置于37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下培养，收集上清，取单抗。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述培养基为加血清的Opti-MEM培养基。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)将CHO细胞株扩大为工作细胞库，将工作细胞库中的CHO细胞加入到培养基中，混匀后离心，弃上清；

2)将细胞重悬于培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm条件下培养，培养至第三天补糖、补培养基；

3)在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下继续培养，隔天补糖、补培养基直至培养的第11天，继续培养至第14天停止；

4)收集上清，离心3分钟，之后收集上清，取单抗；

5)将工作细胞库中的CHO细胞传代培养，培养过程中，取单抗。