[发明专利]一种防止启动子在传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种防止启动子在传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用。

背景技术

生物制药是近年来医药行业中增长速度最快的行业，单克隆抗体作为生物药中最受瞩目的产品类别，近15年来的增长率高达41％。单抗类药物的适应症主要集中在肿瘤和自身免疫类疾病，除此之外还有抗感染、眼科、骨质疏松、心梗、血液系统疾病等。同时因其靶向性强副作用小越来越受患者的青睐。2013年，其中6个单克隆抗体药排名位于全球处方药销售额排行榜的前8名。

与第一、第二代生物技术医药产品相比，新一代产品不是天然物质的仿制，而是对细胞内和细胞表面的各个功能单位包括基因表达的各个环节进行加工。由此可见新一代产品的技术难度更大、研发周期更长、生产成本更高，这也导致了新一代生物医药产品(不管是原研药还是仿制药)的价格居高不下。

但是从疗效方面来看，新一代产品即生物药尤其是单抗靶向性强、半衰期长、疗效持续显著、副作用小等特点，所以越来越多的患者渴望接受单抗药物的治疗，但苦于负担不起高昂的医疗费用。同时越来越多的企业投资大量人力物力致力于单抗药物的研发。

目前已经批准上市的大部分单抗药物其推荐成人临床用药剂量均较大，若要满足广大患者的需求，除去价格方面的因素，产能也是最重要的影响患者使用单抗药物的因素之一。同时，产能的提高也能反过来影响价格的走势，因为产能提高在某种意义上来说是节约了成本，利润空间也有所扩增，降价才能最终实现，价格平民化和产能扩大才能使越来越多的患者使用单抗药物治疗疾病。

通常，细胞基因包含一系列调控元件，调控元件是指具有调节功能的特异DNA序列。大多数真核基因调控以正性调节为主，这些调节机制普遍涉及编码序列两侧的、具有调节功能的DNA序列，称为顺式作用元件。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核基因的这些机能元件区分为启动子、增强子及抑制子。

其中启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。

在一般的CHO细胞的传代培养中启动子会逐渐灭活，继而影响单克隆抗体的产率，不能实现单抗生产上的高产量低成本。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种防止启动子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

本发明还提供了含有所述基因序列的载体。

本发明还提供了含有所述基因序列的CHO细胞株。

本发明还提供了所述细胞株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

1)将CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将质粒DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育后，将二者混匀，室温孵育；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育；

6)观察转入基因表达情况：取培养液上清，WesternBlot检测蛋白量，能检测到蛋白的为成功转入；

7)稳定转染；

8)优化：将稳定转染的细胞挑出来，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，选出蛋白量较高且三次蛋白量之间相差比较小的细胞；

9)建立稳定细胞株。

进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

1)将0.5×10⁵～2×10⁵(个)CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将质粒DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育5分钟后，将二者混合，混匀，室温孵育20分钟；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育4～6h；