[发明专利]一种磁微粒化学发光试剂的制备方法

说明书

本公开涉及一种磁微粒化学发光试剂的制备方法。还涉及一种人肌红蛋白的检测试剂盒。在所述方法中，磁微粒先和交联剂混合，之后再与待包被的抗体进行结合。此外，本公开的方法还采用了聚合物封闭磁微粒。通过本方法制备的检测试剂结合了化学发光和磁微粒技术的双重优势，磁微粒使该试剂盒具有更高的特异性、灵敏度，更大的检测范围和快速的检测时间。

技术领域

本公开属于免疫技术检测领域，尤其涉及一种磁微粒化学发光试剂盒的制备方法，以及采用此方法制备的试剂盒；本公开还涉及一种检测人血清中肌红蛋白的定量试剂盒。

背景技术

肌红蛋白是一种存在于心肌和骨骼肌细胞质的蛋白质，分子量为17.8kD。

在肌细胞受损后，肌红蛋白快速释放到循环系统中。测定血清中的肌红蛋白是诊断急性心肌梗塞(AMI)、再梗塞以及溶栓治疗后成功再灌入诊断的重要指标之一。浓度在症状出现后约两个小时肌红蛋白浓度升高，因此可作为诊断心肌梗塞的早期指标。根据不同的再灌入治疗措施，在梗塞形成开始之后，血液循环中的肌红蛋白浓度在梗塞发生后4到12小时可达到高峰，约24小时之后下降至正常水平。骨骼肌受损后以及肾功能严重障碍也可导致肌红蛋白浓度升高。

在没有骨骼肌损伤的情况下，肌红蛋白用作心肌梗塞病症的早期标志。肌红蛋白的阴性预测结果是99％，用来排除非心肌梗塞患者。当结合其他心脏标志物(如CK-MB或肌钙蛋白I)一起应用时，肌红蛋白具有卓越的诊断价值，可用于评估潜在的急性心肌梗塞患者。

目前临床上采用的肌红蛋白检测手段包括：ELISA法和免疫比浊法。然而，这些方法的缺点在于灵敏度不够高，检测用时长，线性范围不够宽，样本不得不进行稀释处理。

鉴于上述不足之处，人们开发了一种新的检测方法，其结合了磁分离技术和化学发光技术的双重优势，例如中国专利CN102435752B中公开了一种肌红蛋白定量测定试剂盒及其检测方法，该试剂盒包含标记有抗肌红蛋白单克隆抗体的磁性微球、和碱性磷酸酶标记的抗肌红蛋白单克隆抗体。改方法将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，从而提供了一种接近均相的反应体系，具有较高的检测灵敏度和特异性。然而，现有技术中抗体包被磁微粒的方法是先将磁微粒和抗体混合均匀后加入交联剂(如EDC)。即便在CN102435752B中，也是将抗体和交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯进行事先混合。在这些包被方法中，交联剂会损害抗体的活性。并且，试剂线性范围不够宽广，高值样本需要事先进行稀释处理。鉴于此，本领域的技术人员非常希望获得一种新型的磁微粒包被方法以便改善上述技术中的缺陷。

发明内容

根据本申请的一方面，提供一种磁微粒的包被方法，其包括步骤：

a)将磁微粒和结合缓冲液进行接触，获得第一混合物；

b)将碳二亚胺和第一混合物在20℃至30℃接触10min至1h，获得第二混合物；以及

c)将单克隆抗体和第二混合物在20℃至30℃避光反应2h至4h，得到包被有单克隆抗体的磁微粒。

根据一些实施方式，所述结合缓冲液的pH为4.5至6.0；优选地，pH选自：4.5、4.8、5.0、5.2、5.5、以及上述任意两个数值之间的范围。在更优选的实施方式中，所述结合缓冲液的pH为5.0。在具体的实施方式中，所述结合缓冲液是MES缓冲液。在更优选的实施方式中，结合缓冲液是pH为5.0的0.1M MES缓冲液。

根据一些实施方式，所述磁微粒的粒径为1μm至3μm。在优选的实施方式中，所述磁微粒的粒径为0.8至1.2μm。技术人员理解，本公开方法中所用的磁微粒实际上不可能是单个的磁微粒，而是众多磁微粒。因此，磁微粒的粒径在统计学意义上是个粒径范围的分布。例如，当提及粒径为1μm的磁微粒时，并不意味着每一个单个的磁微粒的粒径刚好是1μm，而是允许在1μm附近(例如±10％的误差)的范围之内。鉴于此，在本申请的上下文中，以粒径的范围来表示磁微粒的粒径。