[发明专利]一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒

说明书

本发明涉及涉及一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒。所述单链核酸分子，包括茎环结构区和单链区；所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3’端，且从5’到3’方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；所述第一配对区和第二配对区互补配对；所述单链环区为（dM）_a，M为A、T、C、G或U，a为正整数；所述单链区为（dN）_b，位于所述单链核酸分子的5’端，N为A、T、C、G或U，b为正整数。本发明还提供了基于上述单链核酸分子的聚合酶活性测定方法及试剂盒，可通过荧光检测的方法实现对酶促反应的实时检测，在降低对环境压力的同时，降低了成本，步骤更为简单，且提高了聚合酶活性检测的准确性。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种单链核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒。

背景技术

聚合酶作为一种重要的工具酶，广泛应用于基因测序、载体制备及基因克隆等一系列重要的分子生物学技术之中。目前，市场上常见的DNA聚合酶活性单位定义如下：以浓度为0.75 mM的被激活的小牛胸腺DNA为模板，在反应条件为72℃，1×反应缓冲液（包含200mM Tris-HCl (pH 8.8)、20 mM MgSO4、100 mM KCl、100 mM (NH4)₂SO4、1% Triton X-100、1 mg/mL nuclease-free BSA），0.4 MBq/mL [3H]-dTTP下反应30 min，能催化10 nmol的dNTP聚合生成多核苷酸片段的酶量为1单位酶活，即1U。相应的，市场上常见的聚合酶活性测定方法主要是放射性同位素标记结合凝胶电泳。但是，因为同位素存在辐射，对人体有害，在使用过程中对实验室的要求很高，实验过程中的所有试剂、耗材等均需专门处理，否则会污染环境。一般实验室、公司和研究机构均不具备进行同位素标记法实验的条件。此外，这种方法是一种活性终点测定法，无法实时监测酶促反应进程，测定的可靠性较差；测定的活性线性范围较窄，只有1个数量级，操作也比较复杂费时；基于该方法的试剂盒成本高，使用后需经特殊处理才能不污染环境。

因此需要一种不依赖于同位素标记的聚合酶活性测定方法及试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单链核酸分子以及基于该核酸分子的聚合酶活性测定方法及试剂盒，旨在解决现有技术中聚合酶活性测定对环境压力大，成本高的问题。

为了实现发明目的，本发明提供了一种单链核酸分子，包括茎环结构区和单链区；

所述茎环结构区位于所述单链核酸分子的3’端，且从5’到3’方向依次包括第一配对区、单链环区和第二配对区；

所述第一配对区和第二配对区互补配对；

所述单链环区为（dM）_a，M为A、T、C或G，a为正整数；

所述单链区为（dN）_b，位于所述单链核酸分子的5’端，N为A、T、C或G，b为正整数。

优选的，所述（dN）_b中含嘧啶的碱基占总碱基数的40%-60%。

优选的，所述单链区为（dA）_b、（dT）_b、（dC）_b、（dG）_b或（U）_b。

更优选的，所述单链区为（dT）_b或（dC）_b。

优选的，所述单链区环区为（dA）_a、（dT）_a、（dC）_a、（dG）_a或（U）_a。

优选的，所述第一配对区在5-15bp之间。

优选的，所述a在3-20之间。