[发明专利]一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法

说明书

技术领域

本发明属于植物无性繁殖技术领域，具体涉及到一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法。

背景技术

蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb.)Trev.]，又名千层塔，为石杉属多年生珍稀药用草本蕨类植物，因其体内含有的次生代谢产物——石杉碱甲被证明是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂而倍受全球医药界的关注，并已将石杉碱甲制剂列为治疗老年痴呆症的首选药用于临床与研究。

自石杉碱甲问世以来，其资源问题一直没有得到解决。首先，由于手性明显，合成、半合成均难度很大，虽能在实验室初步成功，但成本上无法达到工业化生产要求；其次，人们尽管在近缘植物寻找、孢子繁殖、人工栽培、组织培养及内生真菌发酵等方面进行了有益探索，但收效甚少，基本上处于研发起步阶段，不具备大规模商业化开发的价值。因此，目前从蛇足石杉植物中提取是石杉碱甲的唯一来源。

蛇足石杉虽然分布较广，但它对生境要求较高，加之其植株矮小，石杉碱甲含量低，生长周期长，资源恢复期长达15年。经多年的极度采挖，野生资源遭到严重破坏，石杉碱甲资源问题日益严峻。据统计全国现有的蛇足石杉储量，尚不足以应付10年的石杉碱甲提取，严重制约了该药的研究与应用前景。

随着全球人口老龄化进程的加速及老年痴呆人群的逐年递增，国内外对石杉碱甲的需求量日益增加，与之相对应的野生资源越发匮乏，使得石杉碱甲市场供求矛盾的日益凸显。如何找到一个能够在短期内突破石杉碱甲制剂产业链资源瓶颈的蛇足石杉快速繁殖技术途径，已迫在眉睫。

发明内容

针对蛇足石杉野生资源短缺，本发明的目的在于，提供一种蛇足石杉无菌苗快速繁育培养的方法，以满足市场需要。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法，其具体操作步骤如下：

（1）芽胞的采集与处理

采集饱满、无病虫害的蛇足石杉植株芽胞，流水冲洗处理0.5-1小时后，放入带润湿吸水纸的培养器皿中，然后于4℃条件下低温保存与处理。

（2）外植体表面消毒

将低温保存与处理的芽胞置于超净工作台中，无菌水清洗2-3遍，无菌纸吸干表面水分；然后浸泡于70%乙醇中30-60秒，无菌水清洗3-5遍；最后置于5%的次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，无菌水清洗3-5遍。

（3）内生菌杀灭培养与芽胞萌发

经表面灭菌的外植体转移至添加2-3g/l苯菌灵可湿粉DW50的改良Moore’s（莫氏）液体培养基中，置于20-23℃、光照强度500-1000lx、光照时间12-14h/d条件下培养3-4周，对外植体的内生菌进行杀灭与芽胞萌发培养。

（4）幼苗的继代与增殖

将已灭菌的外植体转至以苔藓为基质，添加改良Moore’s培养液以及0.015-0.045mg/lIBA，0.3-0.9mg/lKT，0.25-0.75mg/lNAA的植物激素组合体系中，于20-23℃、光照时间12-14h/d、相对湿度70-90%、光照强度1000-3000lx条件下培养，每两个月更换一次培养基。

A、所述的改良Moore’s培养基由下列物质组成：50mg/L硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、25mg/L氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、50mg/L磷酸氢二钾(K₂HPO₄)、50mg/L氯化铵（NH₄Cl）、5.56mg/L硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA·2H₂O)、0.415mg/L碘化钾(KI)、0.125mg/L钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)、0.012mg/L硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)、0.012mg/L氯化钴(CoCl₂·6H₂O)、11.15mg/L硫酸锰(MnSO₄·H₂O)、4.3mg/L硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)、20g/L蔗糖。