[发明专利]一种克百威氨基化半抗原的合成方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种克百威氨基化半抗原的合成方法及应用，属于生物化工技术领域。

背景技术

克百威（Carbofuran,CAR）,化学名为2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯，商品名为呋喃丹，属于氨基甲酸酯类农药。在农业生产中做为广谱性杀虫、杀线虫剂，可以与胆碱酯酶不可逆结合，使得乙酰胆碱不能分解而蓄积在体内，影响神经中枢传导，具有神经毒性。克百威具有内吸性，可以被植物根部吸收并输送到植物体各器官，在土壤中不急降解，极易污染土壤和地下水源，给农产品安全和环境带来潜在威胁。近年来克百威已被禁止用于蔬菜，但仍有不少违法使用现象，导致克百威在果蔬中时有检出，因此，加强农产品中克百威农药残留的检测迫在眉睫。

传统的克百威残留检测多采用仪器分析法，需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，对检材要求较高，样品前处理和提纯过程费时费力，不能满足现代检测对现场、方便、快速的要求。基于免疫反应的酶联免疫吸附法和胶体金试纸条法操作简便，对样本要求不高，可实现现场快速检测的要求。免疫分析法的前提是特异性抗体的制备。克百威分子量为221，是典型的小分子化合物，需要制备人工抗原，且本身不含有可偶联的功能基团，必须进行半抗原合成。目前国内外普遍采用传统的三光气合成工艺制备克百威羧基化半抗原，由于大量光气和甲苯的使用，极易危害人体健康，造成环境污染。因此，本发明以呋喃酚为原料，设计一种新的克百威氨基化半抗原合成方法，并制备了完全抗原，为建立克百威免疫检测技术提供物质基础。

发明内容

本发明针对三光气传统方法合成克百威羧基化半抗原的危害性，提供了一种新的克百威氨基化半抗原合成方法，采用戊二醛法制备人工抗原，制备得到的半抗原和人工抗原可用于克百威免疫分析方法研究。

本发明的技术方案：第一步为氨基化半抗原的制备及检测，以呋喃酚为原料，在三乙酸催化下与二（对硝基苯）碳酸酯发生酯化反应，用3-叔丁氧羰基氨基丙胺进行胺解并N-Boc保护，在盐酸二氧六环下脱保护，最终合成克百威氨基化半抗原；然后利用戊二醛法将半抗原和载体蛋白上的氨基缩合，制备克百威人工抗原。其中克百威氨基化半抗原合成路线为

。

工艺步骤如下。

1.克百威氨基化半抗原合成。

（1）将四口烧瓶置于磁力搅拌器上，配置温度计。取一定量的呋喃酚溶于50mL二氯甲烷（DCM）中，冰浴下加入三乙胺（Et₃N），搅拌10分钟后，将二（对硝基苯）碳酸酯溶于15mL二氯甲烷中，缓慢滴加到上述反应体系中，控制反应摩尔比为呋喃酚：二（对硝基苯）碳酸酯=1:1；逐渐升温至30℃，继续搅拌反应1小时，TLC板监控反应完成，展开剂为石油醚：乙酸乙酯=10:1，合成中间产物（II）。

（2）称取一定量经三乙胺碱化的3-叔丁氧羰基氨基丙胺（与呋喃酚摩尔比为1:1），溶于10mL二氯甲烷中，在冰浴条件下加入到上述反应液中，将温度升到室温并继续搅拌过夜；依次用50mL水和饱和食盐水各洗涤2次；用无水硫酸钠干燥后，过滤除去干燥剂，滤液经真空旋干后经200-300目硅胶柱层析纯化得到中间产物（III），洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯，体积比为12:1，收率为65%。

（3）将步骤2得到的半抗原中间产物（III）溶于5mL1,4-二氧六环中，冰浴下加入15mL盐酸二氧六环，室温反应4小时后将析出固体用30mL石油醚洗涤3次，再以石油醚混合固体，经真空旋干除去水分，得到终产物（IV），收率为67%。

2.克百威人工抗原的合成。

（1）称取一定量的半抗原和载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）溶解在5mL磷酸盐缓冲液中（PBS，0.01M，pH7.4），室温磁力搅拌下至充分溶解后，避光反应并逐滴加入25%的戊二醛（GA）溶液，控制反应摩尔比半抗原：戊二醛：BSA=40~80:35:1，温和搅拌反应30分钟后，向反应液中加入硼氢化钠溶液至终浓度为10mg/mL，然后4℃避光反应2小时，即得到人工抗原混合液。

（2）将人工抗原混合液移入处理过的透析袋中，用0.01M的PBS缓冲液在4℃磁力搅拌下透析2天，再用去离子水透析1天，每天更换3次透析液；透析结束后离心取上清，使用冻干法将其制成粉末，即得到克百威人工抗原：CAR-BSA。

3.克百威人工抗原的鉴定。