[发明专利]易变链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，具体涉及一种来自于易变链霉菌的海藻糖合成酶基因，该基因表达的海藻糖合成酶可以显著提高宿主的耐盐能力。

背景技术

海藻糖在基因工程方面的研究已经获得了一些成就：一是利用海藻糖基因构建特种作物提高了作物的抗逆性能力，二是利用工程微生物的构建和酶工程的合理运用，改进原有的海藻糖的生产方式，提升效率，降低成本。目前很多研究者已经成功将海藻糖基因导入经济作物，使植物作为海藻糖的生物反应器，并大量积累海藻糖。但是现有对于产海藻糖合酶的基因工程菌的研究很少。近年来通过基因工程技术克隆和表达海藻糖合成相关的酶已成为许多科学家研究的方向，而通过基因工程菌生产海藻糖合成相关的酶，并以此作为酶法生产海藻糖的催化物，是生产海藻糖的相对高效的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题有三：一是提供一种携带海藻糖合成酶基因的新的放线菌菌株，具体而言是易变链霉菌StreptomycesmutabilisTRM45540；二是提供该菌株中海藻糖合成酶基因的核苷酸序列及氨基酸序列；三是异源表达海藻糖合成酶基因，包括纯化该蛋白，并检测海藻糖合成酶的酶学特征；四是通过构建基因工程菌，验证海藻糖合成酶基因能够显著提高宿主菌的耐盐能力及工业应用。

本发明提供的技术方案：1.易变链霉菌(Streptomycesmutabilis)TRM45540，该菌株的保藏编号为CCTCCNO：M2015657。2.易变链霉菌TRM45540海藻糖合成酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.如2所述的易变链霉菌TRM45540海藻糖合成酶基因所编码的海藻糖合成酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.如1所述的易变链霉菌TRM45540在工业中的应用。

有益效果：1、克隆获得易变链霉菌中的海藻糖合成酶基因

(1)生长培养基

ISP4培养基：可溶性淀粉10.0g·L^-1，(NH₄)₂SO₄2.0g·L^-1，MgSO₄1.0g·L^-1，K₂HPO₄1.0g·L^-1，CaCO₃2.0g·L^-1，NaCl5g·L^-1，FeSO₄·7H₂O0.001g·L^-1，MnCl₂·7H₂O0.001g·L^-1。28℃培养7d。

(2)活化

YEME培养基：玉米粉16.0g·L^-1，蛋白胨5.0g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1，NaCl20g·L^-1，CaCO₃1.0g·L^-1，FeSO₄·7H₂O0.001g·L^-1。最佳发酵条件为：转速180rpm，初始pH7.2-7.4，接种量8％，装液量80mL/250mL，发酵温度28℃。

(3)操作流程

将放线菌(易变链霉菌StreptomycesmutabilisTRM45540)菌株接种到生长培养基中28℃培养箱内培养7d待生长出丰富的新鲜菌丝体。收集菌丝于20％甘油混匀制成菌悬液，放-20℃保存；按照1％的接种量将菌悬液接种到装有YEME(终浓度0.5％甘油)培养基的三角瓶中，28℃摇床培养36-48h得到新鲜菌液，抽提菌株的总DNA，经PCR扩增获得海藻糖合成酶基因的片段，通过TA克隆得到携带有该基因的克隆子p18T-TreA，并送克隆子测序明确该基因的序列。

2、异源表达海藻糖合成酶

(1)将克隆子p18T-TreAp18T-TreA的载体替换成pET28a

抽提克隆子p18T-TreA和pET28a的质粒DNA，选用BamHI和HindIII两种酶对p18T-TreA和pET28a的质粒DNA在37℃水浴酶切4h。通过琼脂糖凝胶电泳，回收相应的片段。p18T-TreA回收1143bp的片段，pET28a回收5.3kb的片段。将回收的两个片段在T4DNA连接酶的作用下连接，转化BL21，获得pET28a-TreA克隆子