[发明专利]一种利用质谱检测外泌体小分子代谢物的方法

说明书

本发明公开了一种利用质谱检测外泌体小分子代谢物的方法，包括以下步骤：仪器与试剂的准备；制备含铁氧化物纳米颗粒基质；制备外泌体样品，分别取不同比例稀释后的外泌体样品点样在靶板上，室温下干燥；在外泌体样品上点含铁氧化物纳米颗粒基质，室温下干燥；进行质谱检测并对质谱检测结果进行分析，得出结论。该方法采用微纳颗粒材料作为基质，能够在质谱分析中快速、高效的使用极少量的生物样品实现待测分子的定性与定量检测；同时可以去除传统基质的背景干扰和热点效应，实现外泌体样本中代谢分子的检测。

技术领域

本发明涉及质谱检测领域，尤其涉及一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测外泌体小分子代谢物的方法。

背景技术

外泌体是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。外泌体有很多重要的功能，例如执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。外泌体也运输核酸，参与细胞间通讯。总之，其蛋白、RNA和脂肪成分特异，且携带了一些重要的代谢小分子，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用。目前，对外泌体的分析方法主要是涉及蛋白、多肽和基因，而代谢分子的检测与分析仍然存在很大的研究空缺。传统的分析方法如生化法和电喷雾电离质谱(ESI)因为其繁杂的样品预处理方法难以实现对于小分子快速高效的检测。同时，现在普遍使用的方法中单次检测通常需要毫升级别的样品量，这对于小分子的检测都带来了极大的障碍。故我们采用基质辅助激光解析电离质谱(MALDI)，MALDI作为一种新型的软电离生物样品分析方式，能够对不同分子量级别的物质进行分析。它代表了一种简单，快速，精准的方式，能够同时对多种生物分子进行检测。这种方法的有效性不仅在理论上，也在实际应用中得到了应证。但传统的基质容易在小分子量端(m/z<1000)产生背景噪声，对于小分子的检测带来极大的干扰。且在实际的生物体系当中，生物样品通常十分复杂。各种生物大分子的存在，以及不同的酸碱度，含盐量都会对小分子的检测带来阻碍。因此传统的基质难以满足对于小分子检测的需求，一种新型的可以用于生物体系检测，且具有一定的抗干扰和一定的耐盐性的基质材料亟待开发。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种新型的基于颗粒辅助的质谱检测技术。通过采用微纳米级的颗粒材料作为基质，克服传统基质的缺陷，快速、高通量、高灵敏度地定量外泌体中待测分子。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种利用质谱检测外泌体小分子代谢物的方法，包括以下步骤：

步骤1：仪器与试剂的准备：激光解析电离质谱，正离子模式检测，只有信噪比大于10的质谱信号用于定性和定量分析；

步骤2：制备含铁氧化物纳米颗粒基质，含铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤：

2.1：将三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；

2.2：在上述的混合溶液中加入乙酸钠，并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系；

2.3：反应在铁氟龙高压反应釜中进行，150-195摄氏度条件下反应8小时以上，从而形成含铁氧化物纳米颗粒；

2.4：将步骤2.3中得到的含铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗，最后在62～70摄氏度下干燥以备使用；

2.5：将含铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中，作为基质使用；

步骤3：提取外泌体，将稀释后的外泌体样品点样在靶板上，室温下干燥；

步骤4：在外泌体样品上点含铁氧化物纳米颗粒基质，室温下干燥；

步骤5：对步骤4中得到的外泌体样品进行质谱检测；

步骤6：对质谱检测结果进行分析，得出结论。