[发明专利]具有不同表达量的基因的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于判定在等位基因之间表达量不同的基因的遗传多态性检索方法 以及与表型相关的遗传多态性的检索方法。

背景技术

即便是处于基因组相同位点的相同基因，当位于不同等位基因上时其基因表达量 不同的现象是近年来报告的比较新的概念(非专利文献1：KnightJC.Allele-specific geneexpressionuncovered(等位基因-特异性基因表达无遮盖).TrendsGenet.Mar; 20(3):113-6.PMID:15049300、2004年)。

在等位基因之间显示不同表达量的基因大致分为印迹基因和非印迹基因两种。前 者所谓的印迹是指在某种细胞或组织中，当从双亲各遗传一半等位基因时，任意一方受到 生理性钝化(例如甲基化等)，基因的表达被抑制的现象。后者，即非印迹基因中，有时也会 在等位基因之间可见不同表达量的情况。这是由于，基因内或与其邻近的等位基因之间的 基因组的多态性作为调节附近基因的表达的顺式作用区域起作用，产生等位基因之间的基 因表达量的差别。在后者中可见的、由于基因组DNA序列的不同所引起的每个等位基因的表 达变化认为是超过世代遗传而来的性质，会影响个体间的基因表达量的差别、甚至个体的 体质差别、病态及其危险率、或者对药物应答性的不同。

为了测定等位基因之间基因表达量的差别，在同一细胞内、即在相同环境条件下 进行测定是最为精确的。而且在测定等位基因之间的基因表达量的差别时，重要的是能够 鉴定某个RNA是来自于哪个等位基因。因此，能够区别等位基因的多态性(SNP等)必须也存 在于作为基因转录产物的RNA序列上，通过对其进行测定从而能够鉴定。目前已经有数个使 用该RNA上的多态性(SNP)测定等位基因之间的表达量差别的报告(非专利文献2~4：Cowles CR,HirschhornJN,AltshulerD,LanderES.Detectionofregulatoryvariation inmousegenes(在小鼠基因中调节变异的检测).NatGenet.Nov;32(3):432-7. PMID:12410233、2002年；YanH,YuanW,VelculescuVE,VogelsteinB,KinzlerKW. RelatedAllelicvariationinhumangeneexpression(在人类基因表达中相关的等 位基因变异).Science.Aug16;297(5584):1143.PMID:12183620、2002年;Bray NJ,BucklandPR,OwenMJ,O’DonovanMC.Cis-actingvariationinthe expressionofahighproportionofgenesinhumanbrain(顺式作用变异在人脑基 因的高比率表达).HumGenet.2003Jul;113(2):149-53.EpubMay01.PMID: 12728311、2003年)。

这些报告均是组合了RT-PCR法和直接测序反应或单核苷酸延伸反应的技术，即由 mRNA合成cDNA，扩增后，将任意选择的多态性分别地分型，并非是能够同时测定多个基因的 技术。

到目前为止，有一个使用SNP分型用微阵列广泛分析多个基因的报告(LoHS, WangZ,HuY,YangHH,GereS,BuetowKH,LeeMP.Allelicvariationingene expressioniscommoninthehumangenome(在人类基因组中等位基因变异在基因表 达中是常见的).GenomeRes.Aug;13(8):1855-62.PMID:12902379、2003年)。这里， 通过使用了polyT引物的普通RT法将带有PolyA的mRNA转变为cDNA，根据与通常的基因组 DNA分型技术同样的实验规程，利用使用了多个特异引物的多重PCR法调制样品，使样品杂 交于阵列，根据其信号比测定每个等位基因不同的cDNA(mRNA)的表达量比。但是，在带有 polyA的成熟型mRNA中，仅为剪接后的外显子的序列，其长度很短、能够评价的多态性(SNP) 也很少。因此，能够利用的多态性(SNP)有所局限，难以发现在每个等位基因上表达量均有 差别的基因。