[发明专利]一种花生杂交种的分子鉴定方法

说明书

本发明公开了一种花生杂交种的分子鉴定方法。它是对花生杂交种的父本和母本的简化基因组测序，通过对测序结果进行分析，鉴定父本和母本之间SNP分子标记并设计父母本通用引物；提取花生杂交种的基因组DNA，通过PCR反应和酶切的方法验证花生杂交种是否同时具有父本和母本的共同特征片段。该方法能快速、准确鉴定花生杂交种。

技术领域

本发明涉及一种利用分子生物学手段鉴定花生杂交种，属于生物技术领域。

背景技术

中国是世界上生产花生最多的国家，花生生产在国民经济中占重要地位。花生是我国重要的油料作物和经济作物，也可以用来提取重要的工业原料。花生还是我国传统的大宗出口商品，以及重要的营养保健品，在农业种植结构中占据重要地位。

杂交育种是国内外应用最普遍、成效最突出的花生育种方法。杂交育种就是利用不同基因型亲本进行杂交，通过基因重组，使杂交后代出现不同的变异类型，再经过选择培育，形成新品种。新中国成立以来培育并推广的260多个花生新品种，70％以上是通过杂交的方法培育的。在杂交育种过程中，快速准确的筛选到具有父本和(或)母本优良性状的子代个体是非常重要的。

传统的杂交育种方法筛选子代种子主要通过表现型观察杂交是否成功。然而，隐性基因控制的某些表型是通过多代繁殖后才能变现出来，筛选过程长，需要2-3年甚至更长。分子生物学和高通量基因测序技术的快速发展为作物杂交育种的分子鉴定提供了基础，分子鉴定方法快速可靠，可以快速鉴定子代杂交种子的真伪，剔除杂交不成功的种子，极大减少后期的田间管理的工作量。然而，目前为止花生杂交后代分子鉴定还未见相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种花生杂交种的分子鉴定方法。该方法能快速、准确地鉴定花生杂交种。

本发明的技术方案是：一种花生杂交种的分子鉴定方法，其特征是，对花生杂交种的父本和母本的简化基因组测序，通过对测序结果进行分析，鉴定父本和母本之间单核苷酸多态性(SNP)分子标记并设计父母本通用引物；提取花生杂交种的基因组DNA，通过PCR反应和酶切的方法验证花生杂交种是否同时具有父本和母本的共同特征片段。具体如下：

1)父本和母本花生简化基因组测序

收集花生杂交种的父本和母本叶片材料，提取DNA，进行简化基因组测序。简化基因组测序服务包含两种类型建库测序策略，分别为RAD(restriction association siteDNA)测序和GBS(genotyping by sequencing)，两种方法各有优势。本发明采用可以通过对测序数据进行拼接来提高获得更长的序列信息的RAD测序法，从而应用于SSR标记开发、引物设计等。

2)父本和母本花生单核苷酸多态性开发

单核苷酸多态性是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列的多态性，这个变异主要是由于单个碱基的转换或者颠换所引起的。通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C←→T，在其互补链上则为G←→A)，也可能是颠换(C←→A，G←→T，C←→G，A←→T)。通过对父本和母本的RAD测序结果的生物系信息分析，开发在父本和母本之间的SNP分子标记。

3)PCR及PCR产物酶切鉴定

采用改良的CTAB法提取花生杂交种的基因组DNA，作为PCR反应的模板；根据SNP分子标记设计父母本通用引物；通过PCR反应，扩增花生杂交种特异的DNA片段，对该片段酶切，由于所选择的PCR片段只有父本或者母本具有酶切位点，杂交成功的花生杂交种经酶切后应该有大小两个片段，一个来自父本另外一个来自母本。