[发明专利]一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：间接ELISA试剂盒的原料 配方为：包被酶标板1~5个，Mmc标准阳性血清0.5~1.5mL、Mmc标准阴性血清0.5~1.5mL、酶标 二抗300-500μL、50×PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液 10mL-15mL。

2.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：包被 酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为MmcLppA基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获 得LppA重组蛋白，并通过镍柱亲和层析法获得纯化蛋白，使用包被缓冲液稀释为1.0μg/100 μL~3.0μg/100μL，室温包被酶标板12h，3g/100mL的BSA溶液，37℃封闭ELISA反应板1.5h 后即为包被酶标板。

3.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：Mmc标 准阳性血清应用丝状支原体山羊亚种GZ-LD株免疫山羊获得的高免血清，按1:100稀释。

4.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：Mmc标 准阴性血清为采集自丝状支原体山羊亚种血清抗体阴性的山羊血清，按1:100稀释。

5.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述 酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。

6.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述 50×PBST缓冲液为：NaCl400.0g、KCl10.0g、KH₂PO₄10.0g、Na₂HPO₄·12H₂O145g、 Tween-2025mL溶于400~500mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000mL。

7.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述 底物液A为Na₂HPO₄14.60g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，溶于三蒸水，并定容至 1000mL，调至pH5.0～5.4。

8.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述 底物液B为TMB20mg、无水乙醇8~10mL，加双蒸水至1000mL，过滤除菌，无菌分装。

9.根据权利要求1所述一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述 终止液为0.2%～0.3%HF溶液。

10.如权利要求1所述的一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒的使用方法，其特 征在于：包含以下步骤：

第一，取包被酶标板，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；

第二，将阴、阳性对照血清及待检血清做1∶100倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔中， 37℃孵育1h后，应用PBS洗涤ELISA酶标板各反应孔5次；

第三，将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔，37℃作用 1h后，应用PBST洗涤酶标板反应孔5次；

第四，将底物液A和B各50μL加入ELISA反应板，避光室温显色10~15min，加入50μL终止 液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值；

第五，试验成立条件为阳性血清OD630平均值≥3.069，阴性血清OD630平均值＜1.741； 试验结果判定标准为待检样本OD₆₃₀值≥2.738为阳性，待检样本OD₆₃₀值＜2.738为阴性。