[发明专利]一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法。

背景技术

丝状支原体山羊亚种Mmc是致山羊和绵羊发生慢性呼吸道传染疾病及影响养羊业 发展的重要疫病的主要病原菌之一，所致传染性胸膜肺炎潜伏期平均为18~20d，最短的是3 ~6d，最长可达到30~40d。其临床症状表现主要为体温升高、萎靡呆立、食欲减退、呼吸困难 且痛苦呻吟。带菌羊和病羊是该病的主要传染源，该病主要是在接触传播和呼吸道，病死率 较高（EnginBalikci，2008；田青，2006）。1971年Carmicheal分离到具有致病性新型支原 体，且命名为丝状支原体山羊亚种，相继在许多国家如叙利亚、印度、苏丹和肯尼亚等地发 现该病原。我国于在内蒙古曾经流行该病（CarmichaelLE,1972；邹联斌，2007）。丝状支 原体山羊亚种引发的早期支原体肺炎病例长时间以来未曾引起人们的重视，但近年调查发 现，该病死亡率呈不断上升趋势，给养羊业带来严重的经济损失(张双翔，2013)。

对丝状支原体山羊亚种的防控，目前主要依靠药物预防，也可使用疫苗，但防控成 本很高，究其原因与Mmc分离培养费时费力有关（候相山等，2006；赵萍等，2008）。临床疫苗 应用后，目前缺乏疫病检测与防控所需的快速血清学检测手段，尤其可高通量检测、敏感性 高的ELISA方法，缺乏有效的免疫防控效果评估，给养羊业带来严重的经济损失（张双翔， 2012）。构建含MmcLppA蛋白C末端基因的原核表达载体，建立基于表达产物MmcLppA蛋白 的间接ELISA技术十分必要和紧迫。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，选取核苷酸同源性较高的Mmc贵州分离株株，通 过MmcLppA基因原核表达载体的构建与表达，建立基于表达产物MmcLppA蛋白的间接 ELISA方法，并进行条件优化，制备成商品化间接ELISA试剂盒。该间接ELISA试剂盒的发明， 将为Mmc引起的山羊间质性肺炎疫病的早期监测、免疫效果评价提供关键技术，对本病原所 致疫病的早发现早防控具有重要意义。

本发明的技术方案为：

一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒，间接ELISA试剂盒的原料配方为：包被酶 标板1~5个，Mmc标准阳性血清0.5~1.5mL、Mmc标准阴性血清0.5~1.5mL、酶标二抗300-500μ L、50×PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液10mL-15mL。

包被酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为MmcLppA基因通过大肠杆菌Rosseta （DE3）表达系统获得LppA重组蛋白，并通过镍柱亲和层析法获得纯化蛋白，使用包被缓冲液 稀释为1.0μg/100μL~3.0μg/100μL，室温包被酶标板12h，3g/100mL的BSA溶液，37℃封闭 ELISA反应板1.5h后即为包被酶标板。

Mmc标准阳性血清应用丝状支原体山羊亚种GZ-LD株免疫山羊获得的高免血清，按 1:100稀释。

Mmc标准阴性血清为采集自丝状支原体山羊亚种血清抗体阴性的山羊血清，按1: 100稀释。

所述酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。

所述50×PBST缓冲液为：NaCl400.0g、KCl10.0g、KH2PO410.0g、Na2HPO4· 12H2O145g、Tween-2025mL溶于400~500mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000 mL。

所述底物液A为Na2HPO414.60g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，溶于三蒸 水，并定容至1000mL，调至pH5.0～5.4。

所述底物液B为TMB20mg、无水乙醇8~10mL，加双蒸水至1000mL，过滤除菌，无 菌分装。

所述终止液为0.2%～0.3%HF溶液。

一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒的使用方法，包含以下步骤：

第一，取包被酶标板，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；

第二，将阴、阳性对照血清及待检血清做1∶100倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔中， 37℃孵育1h后，应用PBS洗涤ELISA酶标板各反应孔5次；