[发明专利]一种喹诺酮纳米分子印迹聚合物制备方法与应用

权利要求书

1.一种喹诺酮纳米分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）固相载体玻璃珠上引入抗生素

将250~300g玻璃珠加入到120~160mL、1~4mol/L的NaOH水溶液中，加热沸腾10~15分钟，取出玻璃珠用水洗至洗液的pH=8~9，烘干得到羟基化玻璃珠；

将羟基化玻璃珠加入到150mL干甲苯中，再加入3mL3-胺丙基三甲氧基硅烷，剧烈摇动后，室温下放置12~16小时，过滤、丙酮冲洗，得到硅烷化玻璃珠；

在20mL乙腈和80mLpH6.0PBS缓冲溶液中，加入80~120mg喹诺酮类抗生素、80~100mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐和120~150mgN-羟基琥珀酰亚胺，室温放置10~15分钟后倒入100g上述硅烷化玻璃珠中，加1mol/L的NaOH水溶液调节反应液pH至7.4，室温下反应2~3h，抽滤，水洗，干燥，收集喹诺酮抗生素衍生玻璃珠；

（2）合成喹诺酮类抗生素印迹的纳米印迹聚合物

将8.0~10.0mmol甲基丙烯酸、4.0~5.0mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯、3.0~3.5mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、1.0mmol二乙基二硫代氨基羧酸苄酯和0.1~0.15mmol四（3-巯基丙酸）季戊四醇酯溶于10g的乙腈中，得到混合溶液，并所述混合溶液中通氮气20分钟；

取25~30g所述喹诺酮类抗生素衍生玻璃珠于平底杯中，往烧杯中通氮气20分钟；

将所述混合溶液倒入上述烧杯中，紫外照射1~3分钟，得到反应混合物；

将所述反应混合物倒入至固相萃取管中，用6~8床的冷乙腈洗涤玻璃珠，得到半成品玻璃珠，通氮气10分钟；

取220~270mgPEG4000溶于8mL乙腈中，通氮气5分钟后，倒入上述半成品玻璃珠表面，摇动混匀，紫外照射1~3分钟，将所述反应混合物倒入至固相萃取管中，用6~8床的冷乙腈洗涤玻璃珠，然后用100mL、60~70℃乙腈淋洗，得到喹诺酮类抗生素印迹的纳米分子印迹聚合物溶液，自然冷却至室温，用微孔超离心过滤器离心分离得到喹诺酮类抗生素纳米分子印迹聚合物溶液。

2.如权利要求1所述的喹诺酮纳米分子印迹聚合物在检测喹诺酮抗生素方面的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述喹诺酮抗生素的检测包括以下步骤：

（1）酶标物辣根过氧化物酶-模板分子HRP-T的合成

将20~30mg喹诺酮抗生素溶于0.3mL乙腈和2.0mL、pH6.0的MES缓冲液中，再加入0.2~0.4mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐和0.3~0.6mgN-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应15分钟后，立即与10mL含5~8mg辣根过氧化物酶的pH7.40的PBS缓冲溶液孵化2小时，然后用4.0~5.0mLPBS缓冲液洗去未联接的抗生素，用微孔超离心过滤器在转速3500rpm下分离得到酶标物HRP-T溶液；

（2）标准曲线图制作

通过酶联免疫竞争吸附法测定不同浓度喹诺酮抗生素的吸光度，建立抗生素浓度-吸光度的标准曲线图；

（3）喹诺酮抗生素的检测

将预处理后的待检测物通过酶联免疫竞争吸附法测定喹诺酮抗生素的吸光度，根据该吸光度与标准曲线图比对，获取待检测物中喹诺酮抗生素的浓度；

在步骤（2）和（3）中，所述酶联免疫竞争吸附法具体为：将40μL、浓度为0.04~0.06mg/mL喹诺酮纳米分子印迹聚合物溶液包被在微孔盘中；PBS溶液洗涤，然后加入300μL含质量浓度为1.5%的Tween20和质量浓度为0.15%的BSA的PBS溶液；孵化1~1.5h，PBS溶液洗涤，然后每个孔中加入100μL的酶标物HRP-T溶液和喹诺酮抗生素待测液室温下孵化1h，用含Tween20和BSA的PBS溶液洗涤，加入60~100μLTMB试剂显色反应10分钟，加入60~100μL0.5mol/LH₂SO₄溶液终止反应；酶标仪读取器读取450nm处每个微孔溶液的吸光度。