[发明专利]支原体TD-PCR检测方法及引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及支原体的TD-PCR(降落聚合酶链式反应)检测方法及 其引物。

背景技术

支原体是哺乳动物细胞培养过程中的主要污染源，它能够干扰细胞的功能，是困扰实验 室及工业生产的主要问题。哺乳动物细胞广泛应用于生产治疗性生物制品，因此需对其进行 支原体检查以确保产品的纯度及安全性。污染细胞最常见的支原体包括：发酵支原体 (M.fementans)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体 (M.arginina)、唾液支原体(M.salivarium)和人型支原体(M.hominis)。被这些支原体污 染的细胞常常不引起明显的细胞病变，也不导致培养液浑浊，难以凭肉眼发现，因此，建立 一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。

《美国药典/国家处方集》中明确规定了两种检测支原体的方法。其中，培养法需要将细 胞样本直接培养到固体及液体培养基当中来扩增培养。为了检测一些无法培养的支原体，样 本还需被接种到指示细胞当中通过后续DNA染色检测。培养法检测周期长(28天)，检测成 本高，一些治疗细胞的生命周期较短，无法用此方法检测。

多聚酶链式反应(PCR)相对于传统培养法检测支原体具有更加快速经济的优点。一些 PCR引物能够特异性扩增支原体保守序列，并检测绝大部分的支原体，因而PCR法被广泛用 于临床以及实验室细胞及组织支原体的检测。然而PCR法的灵敏性及特异性是其被接受成为 生物医药检测方法的最大障碍。尽管PCR法十分灵敏，能够检测1-10个拷贝值的支原体DNA， 但在哺乳动物细胞的支原体检测中却并不灵敏，检测限大约为1000cfu/ml，超过了培养法的 检测限。虽然细胞培养中支原体的感染水平一般为10⁷-10⁸，但低水平的支原体感染用PCR法 检测易出现假阴性结果。

另外，支原体DNA的提取，目前常用的方法是用苯酚氯仿抽提DNA，这种方法的缺点是： 1、抽提过程较为复杂繁琐；2、苯酚、氯仿对环境及人体的危害性较大；3、时间较长，一般 需两至三天。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种支原体TD-PCR检测方法，它可以提高PCR法检 测支原体的灵敏度和准确性。

为解决上述技术问题，本发明的支原体TD-PCR检测方法，步骤包括：

1)抽提待测样品DNA；

2)采用TD-PCR方法检测待测样品DNA中是否含有支原体。

较佳的，步骤1)，采用Qiagen试剂盒提取待测样品DNA，抽提方法为：用500μLPBS 重悬样本，加入50μL蛋白酶K，涡旋混匀，再加入500μLBufferAL裂解液，涡旋混匀， 在56℃下孵育30分钟，加入117μL3M醋酸铅，2234μL纯乙醇，在-20℃～-30℃下沉淀DNA 60min，再在2-8℃下离心60min以上，离心力16000g以上，用500μL75％的乙醇清洗DNA 沉淀，用焦碳酸二乙酯将沉淀的DNA重悬成0.1μg/μLDNA溶液。

步骤1)，所述TD-PCR方法的PCR反应体系包括：PCR反应体系包括：DEPC水，不含MgCl₂或dNTPs的10×缓冲液，50mMMgCl₂溶液，10mMdNTPs，20μM正向引物，20μM反向引物，5U/μlTaqDNA聚合酶，共40μl。PCR反应条件为：94℃融链；70-60℃退火；72℃延伸。

本发明要解决的技术问题之二是提供用于上述方法的引物对。

为解决上述技术问题，本发明的引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有 如SEQIDNO.1所示的序列或其互补序列，所述反向引物具有如SEQIDNO.2所示的序列或 其互补序列。

本发明利用改进后的QIAGEN试剂盒抽提DNA，再通过TD-PCR方法检测支原体，相比现 有的支原体检测方法，不仅缩短了检测时间，而且增加了检测的特异性和稳定性，同时还减 少了实验过程中有毒有害试剂对于人体及环境的危害，将该方法用于生物制品的放行检测， 检测周期可以由原来的28天降为1～2天，大大缩短了检测周期。

附图说明

图1是用改进的QIAGEN试剂盒抽提样本DNA的流程示意图。

具体实施方式