[发明专利]一种炭角目菌植物内生菌及应用

权利要求书

1.一种炭角目菌植物内生菌，其特征在于，保藏名称为炭角目Xylarialessp；该菌株于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.12248。

2.权利要求1所述的炭角目菌植物内生菌在转化三七总皂苷制备越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌；

(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02％～15％，摇床培养2～5d；

(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：3～1：10的比例，用体积百分比浓度为70％～75％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷10～30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中，继续摇床培养6～12d，其中三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02％～3％；

(4)发酵培养结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声时间10～30min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3～4次，合并上层正丁醇相，减压蒸发浓缩，即得富含皂苷的转化后总皂苷产物；所述炭角目菌植物内生菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.12248。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌具体为：

取4℃斜面保藏的炭角目菌植物内生菌进行活化培养，培养基采用PDB培养基或马丁氏培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中，每瓶含100ml已灭菌培养基，接菌过程在无菌环境进行；灭菌条件：121℃，20～30min；置于20～30℃，摇床培养3～5d，转速设置在100～180r·min-1。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PDB培养基的配制如下：取新鲜市售马铃薯200g，切成3～5mm见方小块，加水1000ml加热微沸30～50min，用4～7层纱布过滤，补足水至1L，然后添加葡萄糖20g，混匀分装灭菌备用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述马丁氏培养基的配制如下：取KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10g，加水定容1L。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌Xylarialessp；

(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02％～15％，摇床培养5～8d；，5000～12000r·min-1离心，取上清液用醇沉法分离出粗酶，然后10000～12000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸缓冲液0.1～2L的比例，用pH6.00～7.00磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀；

(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：3～1：10的比例，用体积百分比浓度为70％～75％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡10～30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的粗酶沉淀的溶解液中，继续摇床培养6～12d，其中三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02％～3％；然后轻轻震摇转化1～5d，即转化获得富含越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的转化后三七总皂苷。